1、ICS 13.020 A 80 GB 中华人民共和国国家标准GB/T 27855一20门化学品土壤微生物碳转化试验Chemicals-Soil microorganisms-Carbon transformation test 2011-12-30发布2012-08-01实施数码防伪中华人民共和国国家质量监督检验检菇总局中国国家标准化管理委员会发布GB/T 27855-2011 目。吕本标准按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。本标准与经济合作与发展组织(OECD)化学品测试导则217(土壤微生物碳转化测试)(英文版)技术性内容相同。本标准作了以下编辑性修改z一一将原文中INTRODU
2、CTION和INITIALCONSIDERA TIONS合并作为本标准的引言;一一增加了范围;将原文中DEFINITIONS中的内容作为标准中的术语和定义气一一计量单位统一改为我国法定计量单位;本标准由全国危险化学品管理标准化技术委员会(SAC/TC251)提出并归口。本标准起草单位:湖北出入境检验检疫局、广东省微生物分析检测中心、国家环境保护部化学登记中心、中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人:崔海容、郭坚、赵晖、曹渭、刘纯新、陈会明、简艳、杨顺风、叶诚。I GB/T 27855-2011 51 本试验方法是为研究单一化学品对土壤微生物碳转化活性所产生的长期潜在影响而设计的。本试验方法以
3、欧洲及地中海地区植物保护组织推荐的试验方法IJ为基础，同时参考了德国联邦生物研究所2J、美国环保局3J、环境毒物学与化学学会及国际标准化组织的试验方法问。1995年，经济合作与发展组织土壤/沉积物工作组在意大利贝尔吉拉太召开了一次会议5，正式确定了本试验中使用土壤的类型和数量。土壤样品的采集、处理、贮存等参见ISO的指南文件及贝尔吉拉太工作组的建议书问。在对受试物进行毒性特征评估时，例如，在需要获得有关农作物保护剂对土壤菌群的副作用数据时，或要揭示土壤微生物接触于除农用化学品以外的其他化学品可能发生的作用时，需要测定化学品对土壤微生物活动的影响。碳转化试验所针对的就是这种化学品对土壤微生物菌群
4、的影响。如果受试物为农用化学品(如农药、肥料、林业化学品)，那么氮转化和碳转化试验全部都要做。如果受试物不是农用化学品，则只需做氮转化试验即可。但是，在试验过程中，如果发现氮转化EC5。值在商用硝化抑制剂(例如，2-氯-6-三氯甲基毗院)的范围内，则应进行碳转化试验以获得进一步的信息。土壤由复杂的、非均相的生物和非生物复合体构成。微生物有机体对肥沃的土壤中有机物质的分解和转化起着非常重要的作用，并且不同的生物种共同作用也可对土壤肥力的各方面产生重大影响。这些生物化学过程中任何变化都可能长期潜在的干扰氮循环，从而改变土壤肥力。碳和氮的转化发生在所有的肥沃土壤中。尽管微生物群体对上述这些过程的作用
5、因土壤类型不同而异，但其转化的途径是基本相同的。本试验方法用于检测一种物质在好氧条件下的土壤表面对碳转化过程的长期不利影响。试验对进行碳转移的微生物群落的数量和活性的改变非常敏感，因为该群落受化学应激和碳应激的影响。砂壤有机质含量低，因而被采用。土壤经受试物处理，并且在允许微生物快速新陈代谢的条件下进行培养。在该条件下，土壤中可用的有机碳会迅速降解，从而引起有机碳的缺乏，使微生物细胞饥饿并导致休眠或者产生芽抱。如果试验超过28d，这些反应的总和在(未处理过的土壤中)对照组中作为一种新陈代谢活动损失的微生物茸的形式被测量71。如果试验条件下，嵌应激土壤中的生物主受到化学品的彭响，则可能无法恢复到
6、与对照组相同水平上。因此，受试物在试验过程中任意时间受到的干扰常会持续到试验结束。该试验方法主要用于土壤中环境浓度含量已知的物质。例如，土壤中使用农药的施用量是已知的。对于农用化学品，只需测定两种剂量浓度(该浓度与预期或者预测的施用量相关)。农用化学品可作为活性成分(a.i. )或者作为配制品进行测定。然而，试验不仅仅适用于具有己知环境浓度的化学物质，通过改变施用于土壤中受试物的量和数据评价的途径，此试验也适用于施用于土壤中未知浓度的化学品。因此，对于非农用化学品，可以利用该方法测定不同浓度对碳转化的影响。试验结果可用于绘制剂量反应曲线图，并用来计算引起土壤中碳转化抑制百分率达x%时的受试物浓
7、度(ECx)值，其中z为碳转化抑制百分率。E GB/T 27855-20门化学品土壤微生物碳转化试验1 范围本标准规定了单一化学品对土壤微生物碳转化活性所产生的长期潜在影响的试验方法。本标准适用于对受试物进行毒性特征评估，碳转化试验针对的是化学品对土壤微生物菌群的影响。2 术语、定义和缩暗语下列术语、定义和缩略语适用于本文件。2. 1 术语和定义2. 1. 1 碳转化carbon transformation 通过微生物将有机物降解形成最终的无机物二氧化碳。2.2 缩暗语EC引起土壤中碳转化抑制百分率达x%时的受试物浓度(effectiveconcentration) ECso引起土壤中碳转化
8、抑制百分率达50%时的受试物浓度(medianeffective concentration) 3 试验的有效性对农用化学品测试结果的评价基于对照土壤和经过处理的土壤样品中所释放的二氧化碳或耗氧量的差异，该种差异相对较小(平均值:1:25%)，因此，对照组中出现较大差异将导致错误的结果。故对照平行样品之间的差异应少于士15%。4 原理预先准备好用受试物处理过的土壤或未被处理的土壤做对照。若受试物是农用化学品，推荐至少用两个测试浓度，其中最低测试浓度应与预计在田间施用的最高浓度相关。在培养od , 7 d , 14 d , 28 d 后，处理的和对照的土壤样品与葡萄糖混合，然后连续测定12h内葡
9、萄糖引起的呼吸速率。呼吸速率以释放的二氧化碳碳(mg)/土壤(kg h) 或消耗的氧氧(mg)/土壤(kg h) 来表示。处理过的土壤样品的平均呼吸速率与对照进行比较，并以对照为基础计算出处理土壤平均呼吸速率差异的百分率。全部测试至少持续28d。如果在第28天处理土壤和未处理土壤之间的差异等于或大于25%，则以14 d为间隔期继续测试，最长至100d。若受试物是非农用化学品，则需用一系列浓度的受试物加到土壤样品中，并在28d后测定葡萄糖引起的呼吸速率(即二氧化碳形成或氧消耗量的平均值)。用回归方法对获得的系列浓度测试的结果进行分析，并计算出ECx值，即ECso，EC2S或EC10。5 试验装置
10、试验容器需用惰性材料制成。应使用与土壤培养所用方法相匹配的适宜容量，即以整体的或一系G/T 27855-2011 列单独的土壤样品进行培养。应注意在测试过程中将水分的损失量减至最小，并能进行气体交换(例如，可用带有小孔的聚乙烯薄膜覆盖测试容器)。在进行挥发性物质的试验时，应用可密封的或不透气的容器。容器的大小应以装好的土壤样品占其总容量的大约1/4为准。为测定葡萄糖引起的呼吸作用，需要具有培养系统、测量二氧化碳产生量或氧气消耗量的仪器8IHIO11106 试验程序6. 1 准备6. 1. 1 土壤的选择使用单一的土壤，土壤具有以下特征:砂粒含量:50%75%; pH:5. 57. 5; 有机氮
11、含量:0.5%-1.5%。应测定微生物的生物量;lmu，其含碳量至少应是土壤总有机碳的1%。在多数情况下，具有以上特征的土壤代表着最差的境况。由于其对测试化学品的吸收量最少，而对微生物菌群的可利用性最大。因此，通常不必要使用其他土壤测试。但是，在某些情况下，预计受试物主要用于特定的土壤，如:酸性的森林土壤，对于带有静电荷的化学品，可用另一种附加土壤。6. 1. 2 土壤样品的采集应了解采集供试土壤田间地点的详细历史信息，包括:准确位置、植被、施用农作物保护剂的日期、使用有机或无机肥料处理的情况、加入的生物材料或偶然混入的污染物。采样选择的土壤应能够长期使用，永久的牧场、一年收获一次种植谷类作物
12、(除了玉米)的耕地，或密植的绿肥田地均是合适的地点。取样地点应满足;至少在取样前一年内未用过农作物保护剂。至少6个月没有施用过有机肥料。除非农作物需要方可施用无机肥料，而在施肥后至少3个月才能取土壤样品。应避免使用那些具有生物杀灭影响的农药或肥料(例如z氟胶化钙处理过的土壤。应该避免在长期(超过30d)干旱或积水期间内取样，或之后立即取样。在耕地中取土壤样品的深度应是ocm20 cmo在较长时期不犁地(至少一个生长季)的草地牧场)或其他类型土壤中取样的最大深度可稍大于20cm(例如25crn)。运输土壤样品时应使用贮存器，同时需要温度条件合适，以保证原始的土壤性质不发生显著改变。6. 1. 3
13、 土壤样晶的贮存测试最好使用从田间新采集的土壤。如需要贮存，则应置于4C:J:2.C的黑暗处，贮存时间不超过3个月。在土壤贮存期间，应保证好氧的条件。如果采集的土壤来自每年至少有3个月封冻的地区，可考虑在一18.C下贮存6个月。每项测试前需测定贮存土壤的微生物量，同时，生物量中的碳含量应大于土壤有机碳总含量的1%。6. 1. 4 受试土壤样晶的处理和制备6. 1. 4. 1 预培养如使用贮存的土壤，建议预培养的时间为2d28 d。预培养期间土壤的温度和湿度应与试验时的情况相同。 GB/T 27855-2011 6. 1. 4. 2 物理化学特性从土壤中人工拣出粗大杂物(例如，石头、植物残体等)
14、，然后湿态过滤(不要过分干燥)，使颗粒不大于2mm。土壤湿度应该用蒸锚水或去离子水调节，使含水量相当于最大持水量的40%60%。6. 1. 4. 3 施入土壤中的受试物的制备受试物一般通过载体来施人。此载体可能是水(用于可溶于水的物质)，或者是惰性的固体物质，如细石英砂(颗粒大小为O.1 mmO. 5 mm)。应该避免使用除水以外的液体载体(有机溶剂，例如:丙酣、三氯甲:院等)，因为它们能损害微生物菌群。如采用沙子做为载体，应将受试物其榕解或者悬浮于相应的溶剂中，然后实施包裹。为了使受试物在土壤中得到最合适的分布，建议沙与土壤(干重)的配比为:10 g沙/kg土壤。对照样品仅用等量的水和石英砂
15、处理。测试具有挥发性的化学品时，在处理过程中应尽量避免其挥发，并应注意保证其在土壤中的均匀分布(例如，应将受试物从多个部位掺入土壤)。6. 1. 5 试验浓度对于环境浓度可以预知的农作物保护剂或其他化学品，至少用两个浓度。设定的较低浓度应至少可以反映在实际条件下预计进入土壤的最大值，所设的较高浓度应为较低浓度的整数倍。加入土壤中的受试物浓度计算依据是:假定受试物与土壤均匀混合至深度为5cm，且土壤容重为1.50对于直接施入土壤的农用化学品或能预测进入土壤用量的化学品，推荐的测试浓度为预测环境浓度(predicteden vironmental concentration, PEC)和预测环境浓
16、度的5倍。预期在一个季节中多次施入土壤的物质，其试验浓度为:预计施入土壤的最多次数乘以预测环境浓度。但是，试验浓度的上限不应超过单一最大施用量的10倍。若受试物为非农用化学品，则至少要用以几何级数排列的5个浓度。测试浓度应涵盖确定EC值所需的范围。6.2 试验操悻6.2. 1 处理与对照如果受试物为农用化学品，应把土壤分成重量相等的3份。2份与含有受试物的载体相混合，而另外1份与不含受试物的载体渥合(即对照)。处理过的与未处理的土壤样品各设置至少3个平行。如果受试物为非农用化学品，则将土壤分成重量相等的6份，其中5份样品与含有受试物的载体混合，剩余1份与不含化学品的载体混合。处理样品或对照样品
17、各设置3个平行。应仔细操作，确保受试物在经处理的土壤样品中棍匀分布。在混合过程中，注意避免使土壤压紧或结球。6.2.2 土壤样晶的培养土壤样品的培养可以两种方式进行:1)各处理过的和未处理的土壤的整体样品;2)各处理过的和未处理土壤的由大小相等的单独子样品组成的一系列样品。在测试挥发性物质时，只能用一系列的单独的子样品来进行培养。以整体土壤样品培养时，需制备的处理过的和未处理的土壤样品量大，在试验中根据需要可以对子样品进行分析。确定每次处理及对照准备土壤样品的初始量的依据是:子样品的大小、样品分析的重复次数及预计的最高采样次数。对整体培养的土壤在再次取样前应充分混合。在培养一系列的单独土壤样品
18、时，将每个处理的和未处理的整体土壤分割成所需要的小份的土壤样品，根据需要使用。当预计实验中采样要超过两次时，制备的小份土壤样品要满足于每次取样和所有平行。测试土壤至少应有3个平行样品在有氧条件下培养。在试验中使用具有足够上部空间的适宜容器，以避3 GB/T 27855-20门免厌氧条件的产生。在测试挥发性物质时，只能用一系列单独的子样品进行培养。6.2.3 试验条件和持续时间试验需在黑暗条件及20oC :l: 2 oC室温下进行。试验期间，土壤样品的湿度应维持在土壤最大持水量的40%60%，变化范围为士5%。在需要时可加蒸懵水或去离子水。试验持续时间至少为28do若受试物是农用化学品，应比较处
19、理样品和对照样品中二氧化碳释放量或氧消耗量。若到第28天测出它们之间的差异大于25%，试验要继续进行或直到它们之间的差异等于或少于25%，或最长至100d，两者取其短。若受试物是非农用化学品，则试验应在28d后结束。在第28天，对处理和对照的土壤样品中二氧化碳释放量或氧消耗量进行测定，并计算ECx值。6.2.4 土壤取样时间表若受试物为农用化学品，则需在od , 7 d , 14 d ,28 d分析土壤样品中的葡萄糖引起的呼吸速率。若应进行更长时间的试验，则应在28d后每间隔14d继续进行测定。若受试物是非农用化学品，则至少用5个试验浓度，并应在开始(0d)和接触期间的最后(28d)分析土壤样
20、品的葡萄糖引起的呼吸作用。若有需要，还可增加一次中间测定，例如在第7天测定。用第28天测得的数据确定化学品的ECx值。若有需要，也可用对照样品第0天的数据估算土壤中有代谢活性的初始微生物量。6.2.5 葡萄糖诱导呼吸速率的测定每次取样时，均需测定每个处理和对照的平行样品中葡萄糖引起的呼吸速率。土壤样品要与足够数量的葡萄糖混合，以迅速产生最大的呼吸反应。可通过使用系列葡萄糖浓度的预备试验来获得产生呼吸反应的最大值所需要的葡萄糖量14。对于含有0.5%1.5%有机碳的砂质土壤可按每千克的土壤(干重)使用2000 mg4 000 mg的葡萄糖。把葡萄糖与石英砂一起研至粉末状，并与土壤(干重)均匀混合
21、(10g砂/kg土壤)。在测定用葡萄糖调整过的土壤样品的呼吸速率时，无论是连续测定、每小时测定、或每两小时测定一次，均要在温度为20oC :l: 2 oC适当的容器中培养。应连续12h测定二氧化碳释放量或氧消耗量，测定应尽快开始，即在增补葡萄糖后的1h2 h内开始。在12h中测定二氧化碳释放总量和氧消耗总量，并确定平均呼吸速率。6.3 质量控制平行的对照样品之间的差异应小于:1:15 %。7 结果和报告7. 1 结果处理7. 1. 1 测试物为农用化学晶若测试物为农用化学品，应记录每个平行土壤样品的二氧化碳释放量或氧消耗量，并将所有重复样品的平均值以表格形式列出。其结果应采用适当的、通用的统计
22、学方法(例如，F检验，0.5%显著性水平)进行评价。葡萄糖引起的呼吸速率以:碳(mg)/土壤(kg0 h) 或氧(mg)/土壤(kgoh)J来表示。每个处理样品的平均二氧化碳生成率或平均的氧消耗速率与对照进行比较，并计算出与对照的百分比差值。4 GB/T 27855-2011 7. 1. 2 测试物为非农用化学品若测试的是非农用化学品，则测定每个平行样品中的二氧化碳释放量或氧消耗量，并绘制剂量-反应曲线，以估算出ECx值。在28d之后，比较处理样品与对照样品的葡萄糖引起的呼吸速率即碳(mg)/土壤(kg.h)或氧(mg)/土壤(kg h) 。用以上数据，可计算出每个试验浓度下的抑制百分率(%)
23、。用这些百分数对浓度对数作图，并用统计学方法计算出ECx值及其95%置信度ISJ16J17J。7. 1. 3 结果说明在评估农用化学品的测试结果时，在28d之后的任何时间所取样品，若其低浓度处理(即最大的预计浓度)与对照之间的呼吸速率差异等于或低于25%时，可认为该产品对土壤中的碳转化没有长期影响。当评估除农用化学品以外的其他化学品的测试结果时，可采用ECso，ECzs和(或)EClO值。7.2 报告结果报告应包括以下信息:a) 测试土壤的完整信息包括:一一-采样点的地理坐标(纬度、经度); 采样点的历史信息(即植被覆盖、农作物保护剂的使用、肥料的使用、意外的污染物等); 利用形式(例如，农业
24、土壤、森林等h一一-取样深度(cm); 一一砂粒/粉砂/粘粒的含量(%干重); 一-pH(在水中); 一一有机碳含量(%干重); 一一氮含量(%干重); 一一阳离子交换量(mmoljkg); 以占总有机碳的百分比表示的微生物量;一确定每种参数的试验方法的参考文献;一有关土壤样品的采集和保存的全部信息;土壤预培养的细节(如有此步骤)。b) 受试物:一一物理性质，以及相关的物理-化学性质;一一化学鉴定数据，包括:结构式、纯度(对于农作物保护剂，是指其中活性成分的百分比)，含氮量。c) 试验条件:一一用有机底物调整土壤的详细资料;一一一测试化学品的浓度值，适当说明所选浓度的合理性;一一向土壤中施用受
25、试物的详细资料;一一培养温度;一一在开始和在试验期间的土壤湿度;一-土壤培养的方法(整体的或一系列单独的子样品); 一一-试验样品的平行数;一-取样次数。试验结果应包括以下信息:a) 用于测试呼吸速率的方法与设备;民、，GB/T 27855-2011 6 b) 列表数据，包括二氧化碳量或氧量的单个值与平均值;c) 在处理样品与对照样品中各平行样品之间的差异;d) 若计算中进行了有关修正，在有关处加以说明;e) 每次取样时，葡萄糖引起的呼吸速率的百分率变化，或适当说明EC5。值及其95%置信度，其他ECx(即ECZ5，或EC10)及其置信区间，并绘制剂量-反应曲线图;f) 结果的统计学处理(在适
26、当处说明); g) 有助于解释结果的全部信息和观察资料。, GB/T 27855-2011 参考文献lJ EPPO (1994). Decision-Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: Soil Microflora. EPPO Bulletin 1994 ,24: 1-16 2J BBA (1990). Effects on the Activity of the Soil Microflora. BBA Guidelines for the
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