1、ICS 13.300 A 80 道国中华人民共和国国家标准GB/T 27859-2011 化学品沉积物-水系统中摇蚊毒性试验加标于沉积物法Chemicals-Sediment-water chironomid toxicity test一Spiked sediment method 2011-12-30发布2012-08-01实施数码防伪中华人民共和国国家质量监督检验检茂总局中国国家标准化管理委员会发布GB/T 27859-2011 前言本标准按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。本标准与经济合作与发展组织(OECD)化学品测试导则218(沉积物-水系统中摇蚊毒性试验加标于沉积物法(英
2、文版)技术内容相同。本标准做了下列结构和编辑性修改:一一为与现有系列国家标准一致，将标准名称改为化学品沉积物-水系统中摇蚊毒性试验加标于沉积物法; 一-将OECD218中的介绍作为本标准的引言;一一将OECD218中的附件1术语和定义作为本标准的第3章术语和定义。本标准由全国危险化学品管理标准化技术委员会(SAC/TC251)提出并归口。本标准起草单位:江苏出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人:张军祖、陈会明、周秋红、徐炎、了华、陆卫群。I GB/T 27859-2011 51 本标准用于评估化学品长期暴露对处在沉积物中的淡水双翅目摇蚊属(Chironomus sp. )
3、幼虫的影响。它以已有的Chironom削rzrius和Chironomustentans的毒性试验方法为基础，上述摇蚊毒性试验方法已在欧洲口-3和北美4-8建立并通过了比对试验1，6，9。本标准也可使用其他已有充分实证的摇蚊种类，如Chironomusyoshimatsui川1。应根据试验的应用目的选择适当的暴露场景。本标准中的暴露场景是在沉积物-水系统中将定量的受试物质添加于沉积物中，即加标于沉积物。该暴露场景用于模拟沉积物中存在的化学品的蓄积水平。要用沉积物中的生物测试的受试物质通常可在这个系统中存在很长时间。沉积物中的生物可通过多种途径暴露受试物质。每种暴露途径的相对重要性，以及每种暴露
4、的时间对总体毒性效应的贡献，取决于相关化学品的理化特性。对于强吸附物质(如19Kow5的物质)，或与沉积物共价结合的物质，让受试生物摄取加了受试物的食物可能是一条重要的暴露途径。为了不低估高亲脂性物质的毒性，可考虑在使用受试物之前向沉积物中加入饲料。为了将所有潜在的暴露途径纳入考虑之中，本标准将重点关注长期暴露。C.riarius和C.yoshimatsui的试验持续时间为20d28 d ,C. tentans为28d65 d。如果因特殊目的，需要短期数据，例如研究不稳定化学品的毒性效应，可用附加的平行试样进行试验，并在10d后放弃。试验的最终结果为羽化的成虫总数和羽化时间。如果需要额外的短期
5、数据，建议只能适当增加额外的平行试验，在试验进行10d后，进行幼虫的存活和生长的测量。E 本标准建议使用人工配制沉积物。与天然沉积物相比，配制沉积物有几个优点:一一因为配制沉积物为可再生的标准化基体，减少了实验的不确定性，并且没必要去寻找未被污染的清洁沉积物来源;一试验可在任何时候开始，而不必面对试验沉积物的季节性变化，也不必对沉积物进行预处理，以去除本土动物群。使用配制沉积物也减少了去野外收集足茧的用于常规试验的沉积物的相关费用;使用配制沉积物，使毒性数据可以相互比对，从而进行物质的毒性分类。1 范围化学晶沉积物-75的物质)或者与沉淀物共价结合的物质时，应在陈化期前向配制沉积物中加入足量的
6、饲料以确保幼虫的生存和自然生长。对此，应使用植物性饲料替代鱼饲料。例如，加入0.5%(干重)的磨细的植物叶子，叶子来源于剌草麻(Ulticadioeca)、桑树(Morusalba )、白三叶草(Trifoliumrepens)、菠菜(Sinaciaoleracea) ，或者其他植物原料(Cero灿yl或者透明纤维素)。10. 1. 8 孵化条件10. 1. 8. 1 加入幼虫24h后要给试验容器中的上覆水柔和通风，并且保持到试验结束(应注意溶解氧的浓度不得低于ASV的60%)。通风是通过固定在沉积层之上2cm3 cm处的一根玻璃巴斯德吸管进行的(即每秒1个或数个泡沫)。当试验挥发性化学物时，
7、则不能给沉积物-水系统通风。10. 1. 8. 2 试验应在20.C士2C的恒温条件下进行。对于C.tentans和C.yoshimat町，推荐的温度分别是23.C:l:2.C和25.C士2.C。通常使用16h的光照周期，光照度应为500lux 1 000 lux。5 GB/T 27859-2011 10. 1. 9 暴露时间暴露从幼虫加入加标容器和对照容器时就开始。c.riparius和C.yoshimatui的最长暴露时间是28 d , C. tentans是65d。如果蚊羽化较早，试验可在对照容器中最后一只成虫羽化之后的至少5d后结束。10.2 观察10.2. 1 羽化10.2. 1.
8、1 测定发育时间和完全羽化的雌雄蚊总数。从其羽状触角可轻易识别雄蚊。10.2. 1. 2 每周至少进行三次观察，与对照容器中的幼虫相比较，目估加标容器中的幼虫的任何反常行为(例如离开沉淀物、非正常游动)。在预期的羽化期间，应每天对羽化蚊计数，每天记录完全羽化蚊的性别和数量。经过鉴别之后，应把蚊从容器中移出。应记录试验终止前的所有产出的卵块，然后移出，以防止幼虫再次引人沉积物。应记录能观察到的未能羽化的蝠数量。羽化的测量方法见附录Da10.2.2 发育和存活如果需要幼虫10d的存活和发育资料，应在试验开始时，额外准备试验容器，以便在随后的试验中使用。使用250m的滤网过滤从这些额外的试验容器中取
9、出的沉淀物，滤出幼虫。对死亡的界定是死去，或者对机械剌激没有反应。未能再找到的幼虫也要统计为死亡(那些在试验初期就死去的幼虫可能已经被微生物分解)。测定每个试验容器中存活幼虫的干重(应无杂质)，计算每个试验容器中的平均单个幼虫干重。确定存活的幼虫处于哪个虫龄是很有用的，为此应测量每个幼虫的头壳宽度。10.3 分析试验10.3. 1 受试物的浓度10. 3. 1. 1 试验开始(即加入幼虫)前，针对每种试验浓度条件，应至少从其中的一个试验容器中取出沉积物，检测其中的受试物浓度。建议在试验的开始和结束时，至少对最高浓度组和一个较低浓度组中的上覆水、间隙水和沉淀物样本进行测定。受试物浓度的检测结果可
10、以显示受试物在水-沉积物中的行为或分布情况。10.3. 1. 2 当要做期间测量(例如第7d)，以及需要分析大量的样本时，样本的取出势必影响整个试验系统，此时应采用额外的试验容器;这些额外的试验容器在与正式试验容器相同的条件下进行处理(包括引入受试生物)，但不用来作生物学观察，仅用于从中进行取样分析。10.3. 1. 3 推荐用离心法分离间隙水，条件为:10000 g(g为自由落体加速度值)、4ac、30min。但是，如果能够证实受试物不被吸附在过滤器上，也可以用过滤法。在一些情况下，因为试样量太少，几乎不可能分析间隙水的浓度。10.3.2 理化参数用适当方法测量试验容器中的pH和温度(见第7
11、章)。在试验开始和结束时，应测量最高浓度的一个试验容器以及对照容器中的硬度和氨度。门数据和报告11. 1 结果处理11.1. 1 本试验的目的是测定受试物对摇蚊发育速率和完全羽化的雌雄蚊总数的影响，或者在为期GB/T 27859-2011 10 d的试验中测定受试物对存活幼虫的数量和质量的影响。如果没有迹象显示摇蚊性别对统计灵敏度存在差异时，则雌雄的结果可以合并统计。灵敏度差异存在与否可用统计方法判定，例如X2-rX2表检验。在为期10d的试验中，应测定幼虫存活数和每个容器中的平均个体干重。11. 1. 2 根据试验开始时测得的沉积物中受试物浓度来计算效应浓度，效应浓度应以干态质量为基础。11
12、. 1. 3 为了计算ECso或其他ECx值，每个试验容器的统计数据值可当作真实的平行试验值。计算任何ECx的置信区间时，应考虑这些数值之间的偏差，或者要证明偏差小到可以忽略不计。当适用最小平方模式时，每个试验容器的统计数据值需通过转换来改善偏差的同质性。但计算EC值时，应将响应数据转换回原值。11.1. 4 为了测定NOEC/LOEC，当用假设检验法进行统计分析时，应考虑到每个试验容器的统计数据值的偏差，此时可用嵌套的ANOVA法;或者，当不符合通常的ANOVA法设定时，则需要进行更多更充分的试验阳。11.2 羽化率11. 2. 1 羽化率是离散数据，当剂量-效应关系预期为单向，并且这些数据
13、也符合这一预期时，可用递减的方法进行Cochran-Armitage检验。否则，应使用Fisher精确检验或者Bonfeeroni-Holm修正p值的Mantel-Haentzal检验。当相同浓度的平行试验的偏差比二项式分布更大(通常被称为外二项式偏差)，则应用稳健的Cochran-Armitage检验或者Fisher精确检验。11. 2. 2 每个试验容器中蚊的羽化总数矶，除以加入的幼虫的数量叭，即得羽化率，见式(1): 式中zER-羽化率;ne一一每个容器中羽化蚊的数量;na一一每个容器中加入的幼虫数。ER=旦旦n. . ( 1 ) 11. 2. 3 当存在外二项式偏差时，最适合于大样本量
14、的可选方法就是把羽化率当成一个连续的效应值。当剂量-效应关系预期为单向，并且ER值也符合这一预期时，应用像William检验这样的程序。当剂量-效应关系不保持单向时，则适用Dunnett检验。这里把大样本量定义为z在一个平行试验(一个容器)中，羽化数和未羽化数都超过5011. 2. 4 使用ANOVA方法时，ER的值应该通过平方根-反正弦转换或Turkey-Freeman转换以获取一个近似正态分布并使方差齐性。当使用绝对频数时，可以应用Cochra任Armitage检验、Fisher精确(Bonferroni)检验或Mantel-Haentzal检验。平方根-反正弦转换是对ER的平方根求反正弦
15、(sine一1)值。11. 2. 5 使用回归分析计算羽化率ECx(例如可使用probit町、logit、Weibull、或合适的商用软件等)。如果不能用回归分析(例如部分效应值少于两个)，则使用其他非参数方法比如移动平均或简单插补。11. 3 发育速率11. 3. 1 平均发育时间表示由从刚引人幼虫(试验第od)到大群实验性羽化成虫所跨越的平均时间(为了正确计算发育时间，应考虑幼虫引人时的虫龄)。发育速率(单位:l/d)是发育时间的倒数，表示每天羽化的幼虫的比率。对于评估沉积物毒性研究而言，发育速率更重要，因为与发育时间相比，它的偏差更低，更均一，更接近正态分布;因而更有效的参数检验程序可以
16、用于计算发育速率而不是发育时间。因为发育速率是一个连续效应值，EC值可以使用回归分析来估算22叫。11. 3. 2 对于下列统计检验，观察第z天所观察到摇蚊数量假定为从第z天到第x-L天(L=观察间隔的长度，通常为1d)中羽化而成。每个容器的平均发育速率(x)根据式(2)计算z7 GB/T 27859-2011 二=垃f式中zz 每个容器的平均发育速率Ei一一观察间隔指数;m一一观察间隔最大值;f;一一观察间隔i中所羽化的摇蚊数量;ne一一至实验最后阶段所羽化的摇蚊总数(= f); X;一一在观察间隔i中所羽化的摇蚊发育速率。11. 3. 3 在观察间隔i中所羽化的摇蚊发育速率X;按照式(3)
17、计算:X; = l/(d;一专)式中zd;一一观察的天数(从加人幼虫起算的日期hl; 观察间隔i的长度(日期，通常为1d)。11. 4 试验报告11. 4. 1 受试物:. ( 2 ) ( 3 ) 一一物理特性，相关的物理-化学特性溶解度，蒸汽压，土壤(或沉淀物中)的分配系数，水稳定性等; 一一化学识别信息(通用名、化学名、结构式以及CAS号等)，包括纯度和定量分析方法。11. 4. 2 受试生物:试验使用的生物的种类、学名、来源和饲养条件;处理卵块和幼虫方法的信息;加入试验容器时受试生物的虫龄。11. 4. 3 检测条件:使用的沉积物，如:天然或人工配制的沉积物;对于天然沉积物，应记录沉积物
18、取样地区的位置并作描述。如可能，还应包括污染史和天然沉积物的特性:pH值、有机碳含量、碳氮比率和粒度(如合适); -一-配制沉积物的制备z成分和特性(在试验开始前有机碳含量，pH值，水分等); 一一试验用水的准备(如使用配制水)及其特性(在试验开始前的氧浓度，pH值，传导率，硬度等); 一一沉积物和上覆水的厚度;一一上覆水和间隙水的体积，沉积物分别含间隙水和不含间隙水的质量;一一试验容器(材料和尺寸); 一一一加标沉积物的方法:检测浓度，平行试样组数和使用的溶剂(若使用); 一一加标沉积物-水系统的稳定平衡阶段:持续时间和状态;一一孵化条件:温度，光照周期和强度，通风(频率和强度h一一喂养方面
19、的具体信息包括饲料的种类、制备、喂养数量和喂养方案。11.4.4 结果:8 一一理论试验浓度，实际测量的试验浓度和决定试验容器中试验物浓度的所有分析结果;试验容器中的水质，如:pH值、温度、溶氧量、硬度以及氨度;如果在试验过程中对蒸发了的试验用水进行了补偿，则应记录;一一每天每个容器内成长为雄蚊和雌蚊的数量;GB/T 27859-20门一一每个容器内没能成长为摇蚊的幼虫的数量;一一每个容器内单个幼虫的平均干态质量;如合适，测量每一龄虫的平均干态质量;每个平行试样和每个检测浓度的羽化百分率(雄蚊和雌蚊合计); 一一每个试验容器中的完全羽化成蚊的平均发育率和处理率(雄蚊和雌蚊合计); 一一估计毒性
20、效应值，例如ECx(及其相关的置信区间)，NOEC和/或LOEC，以及所用的统计方法:一一结果讨论，包括任何偏离本标准会对试验结论产生的影响。9 GB/T 27859-20门附录A(资料性附录)推荐的摇蚊培养方法A.l 摇蚊培养方法摇蚊幼虫的培养可以在沉积器皿或更大的容器中进行。在容器的底部铺上一薄层石英砂，厚度约5 mm10 mm，也可以用硅藻土(女日Merck，Art 8117)代替(厚度更薄，仅需几毫米就足够)。然后加入适用的水，水深数厘米。应补充蒸发损失，保持水位，防止干燥。如需要，可以更换水。还应提供平缓的通风。摇蚊幼虫的培养箱外面应加一个笼子，以防止羽化后成虫的逃逸。笼子应足够大(
21、至少30cmX 30 cmX 30 cm)，这样成虫能成群并交配。笼子应放置于室温下或温度为20.C士2.C的恒温环境中16h光照(强度1000lx) , 8 h黑暗。据报道，空气湿度(RH)小于60%会阻止摇蚊的繁殖。A.2 培养水任何适用的天然水或配制水都可使用。一般推荐使用井水、去氯的自来水和人工介质(如下述Elendt M4或M7勺。水在使用前应鼓氧。如需要，培养水可以用倾倒或虹吸法更换，应小心别损害到幼虫的管状巢。A.3 幼虫的喂食摇蚊幼虫用鱼食喂养(用TetraMin , Tetra Phyll或其他类似品牌鱼食)每天每笼大约250mg。可以给干的粉末或用水调配成悬浮液:1. 0
22、g碎鱼食加入20mL 715-0%高岭石粘土高岭石含量二三30%有机碳添加泥炭和砂来调整碳酸钙粉状CaC03(化学纯)水电导率10S/cmB.2 制备GB/T 27859-2011 沉积物干重百分比/%4-5 75-76 20 2土0.50.05-0.1 30-50 泥炭风干后，磨至微细粉末。用高性能均质化装置将置于去离子水中的一定量泥炭粉末制成悬浮液。用CaC03调整此悬浮液的pH值至5.5土0.5。在20.C士2.C下，温和搅拌此悬浮液，并陈化至少2 d，以稳定pH值，并建立稳定的微生物组分。再次测量pH值应在6.0士0.5。然后，将此泥炭悬浮液棍入另外的组分(砂和高岭石粘土)和去离子水，
23、获得均匀的沉积物。此沉积物水含量应在沉积物干重的30%50%范围内。此最终混合物的pH值需再次测定，并控制在6.5-7.5，需要时用CaC03调节。取沉积物样品，检测干重和有机碳含量。在作摇蚊毒性试验前，建议在与后续试验相同条件下将此配制沉积物陈化7d。B.3 贮存用来制备人工沉积物的干组分可以在室温下贮存在干燥阴凉的地方。配制沉积物(湿的)在试验前不能贮存，应在7d陈化结束后立即使用。13 GB/T 27859-2011 附录C(规范性附录)稀释用水的化学特性要求C.1 稀释用水的化学特性要求见表C.l。表C.1稀释用水的化学特性要求物质浓度颗粒物20 mg/L 总有机碳2 mg/L 未离子
24、化的氨1g/L 硬度以碳酸钙计400 mg/L 残留氯10问/L总有机磷农药50用/L总有机氯农药+多氯联苯50阅/L总有机氯邵阳/La当硬离子和受试物有相互作用时，应使用低硬度水(这种情况下，不能使用Elendt介质M的。14 GB/T 27859-20门附录D(规范性附录)羽化网罩示意图D.l 羽化网罩放置于试验烧杯上，从第20d到试验的最后应放置这些羽化网罩。所使用的羽化网罩示例见图D.l。杯杯出.，料烧网网塑口筛筛的开换物龙置边交积尼倒无水水沉仁仁A 一一一-一一一一E-一一-一一-F图D.l羽化罔罩示意图15 GB/T 27859-2011 参考文献lJ BBA (1995). Lo
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38、国家标准沉积物-水系统中摇蚊毒性试验加标于沉积物法GB/T 278592011 国中化学晶唔中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(10004日网址总编室:(010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销* 开本880X 1230 1/16 印张1.5字数34千字2012年5月第一版2012年5月第一次印刷* 书号:155066. 1-44711 24.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107定价GB/T 27859-2011 打印H期:2012年6月18日F002
