1、ICS 13.300 A 80 GB 中华人民共和国国家标准化学品GB/T 27858-20门沉积物-水系统中摇蚊毒性试验加标于水法Chemicals-Sediment-water chironomid toxicity test-Spiked water method 2011-12-30发布数码防伪中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会2012-08-01实施发布G/T 27858-2011 目IJI=l 本标准按照GBjT1. 1一2009给出的规则起草。本标准与经济合作与发展组织(OECD)化学品测试导则219(化学品试验指南沉积物-水系统中摇蚊毒性试验加标于水
2、法)(2004年4月)(英文版)技术性内容相同。本标准做了下列结构和编辑性修改:一一为与现有系列国家标准一致，将标准名称改为化学品沉积物-水系统中摇蚊毒性试验加标于水法); 将OECD219中的介绍作为本标准的引言气一一将OECD219中的附件1术语和定义作为本标准的第3章术语和定义;附件2、附件3、附件4以及附件5分别对应本标准的附录A、附录B、附录C以及附录Do本标准由全国危险化学品管理标准化技术委员会(SACjTC251)提出并归口。本标准起草单位:江苏出入境检验检疫局、中国化工经济技术发展中心。本标准主要起草人:王红松、汤礼军、刘君峰、王晓兵、戴雨罪。I GB/T 27858-2011
3、 引本标准用于评估化学品长期暴露对处在沉积物中的淡水双翅目摇蚊属(Chironomussp. )幼虫的影响。本标准主要以BBA标准为基础，使用一种沉积物-水系统，包括人造土壤和水柱体暴露场景旧，同时也借鉴了己有的对ChironomusriParius和Chironomustentans的毒性测试方法，上述摇蚊毒性试验方法已在欧洲和北美2-8J建立并通过了比对试验I，6，9J。本标准也可使用其他已有充分实证的摇蚊种类，如Chironomyoshimatsui10川。本标准的暴露场景是将受试物质加入水中。应根据试验的应用目的选择适当的暴露场景。水暴露场景(包括将受试物加入水柱体中)是旨在模拟农药喷
4、撒漂移的场景，同时也考虑到了间隙水中浓度的初始峰值。除了当累积过程的持续时间大于试验周期时，本标准对其他类型的暴露(包括化学物质溅出)也很有用。要用沉积物中的生物测试的受试物质通常可在这个系统中存在很长时间。沉积物中的生物可通过多种途径暴露受试物质。每种暴露途径的相对重要性，以及每种暴露的时间对总体毒性效应的贡献，取决于相关化学品的理化特性。对于强吸附物质(如辛醇/水分配系数19Kow5的物质)，或与沉积物共价结合的物质，让受试生物摄取加了受试物的食物可能是一条重要的暴露途径。为了不低估高亲脂性物质的毒性，可考虑在使用受试物之前向沉积物中加入饲料。为了将所有潜在的暴露途径纳入考虑之中，本标准将
5、重点关注长期暴露。C.rianus和C.yoshimatsui的试验持续时间为20d- 28 d , C. tentans为28d-65 d。如果因特殊目的，需要短期数据，例如研究不稳定化学品的毒性效应，可用附加的平行试样进行试验，并在10d后放弃。试验的最终结果为羽化的成虫总数和羽化时间。如果需要额外的短期数据，建议只能适当增加额外的平行试验，在试验进行10d后，进行幼虫的存活和生长的测量。E 本标准建议使用人工配制沉积物。与天然沉积物相比，配制沉积物有几个优点:二一因为配制沉积物为可再生的标准化基体，减少了实验的不确定性，并且没必要去寻找未被污染的清洁沉积物来源;一一试验可在任何时候开始，
6、而不必面对试验沉积物的季节性变化，也不必对沉积物进行预处理，以去除本土动物群。使用配制沉积物也减少了去野外收集足量的用于常规试验的沉积物的相关费用;一一使用配制沉积物，使毒性数据可以相互比对，从而进行物质的毒性分类。1 范围化学晶沉积物-715的物质)或者与沉淀物共价结合的物质时，应在陈化期前向配制沉积物中加入足量的饲料以确保幼虫的生存和自然生长。对此，应使用植物性饲料替代鱼饲料。例如，加入0.5%(干重)的磨细的植物叶子，叶子来源于剌事麻(Ulticadioeca)、桑树(Morusalba)、自三叶草(Trifolium repens)、菠菜(Sinaciaoleracea) ，或者其他植
7、物原料(Cerohyl或者透明纤维素)。10. 1. 7 孵化条件10. 1. 7. 1 加入幼虫24h后要给试验容器中的上覆水柔和通风，并且保持到试验结束(应注意溶解氧的浓度不得低于ASV的60%)。通风是通过固定在沉积层之上2cm3 cm处的一根玻璃巴斯德吸管进行的(即每秒1个或数个泡沫)。当试验挥发性化学物时，则不能给沉积物-水系统通风。10. 1. 7. 2 试验要在20.C士2.C的恒温条件下进行。对于C.tentans和C.yoshimat町，推荐的温度分别是23.C和25.C土2.C。通常使用16h的光照周期，光照度应为500lx 1 000 lxo 10. 1.8 暴露时间暴露
8、从幼虫加入加标容器和对照容器时就开始。C.riParius和C.yoshimatui的最长暴露时间是28 d , C. tentans是65d。如果蚊羽化较早，试验可在对照容器中最后一只成虫羽化之后的至少5d后结束。5 GB/T 27858一201110.2 观察10.2.1 羽化10. 2. 1. 1 测定发育时间和完全羽化的雌雄蚊总数。从其羽状触角可轻易识别雄蚊。10.2. 1. 2 每周至少进行三次观察，与对照容器中的幼虫相比较，目估加标容器中的幼虫的任何反常行为(例如离开沉淀物、非正常游动)。在预期的羽化期间，应每天对羽化蚊计数，每天记录完全羽化蚊的性别和数量。经过鉴别之后，应把蚊从容
9、器中移出。要记录试验终止前的所有产出的卵块，然后移出，以防止幼虫再次引人沉积物。要记录能观察到的未能羽化的蝠数量。羽化的测量方法见附录Do10.2.2 发育和存活如果需要幼虫10d的存活和发育资料，应在试验开始时，额外准备试验容器，以便在随后的试验中，使用它们。使用250m的滤网过滤从这些额外的试验容器中取出的沉淀物，滤出幼虫。对死亡的界定是死去，或者对机械剌激没有反应。未能再找到的幼虫也要统计为死亡(那些在试验初期就死去的幼虫可能已经被微生物分解)。测定每个试验容器中存活幼虫的干重(应元杂质)，计算每个试验容器中的平均单个幼虫干重。确定存活的幼虫处于哪个虫龄是很有用的，为此，需要测量每个幼虫
10、的头壳宽度。10.3 分析试验10.3. 1 受试物的浓度10.3. 1. 1 在试验开始(加入受试物质1h后更适宜)和结束时，应至少对最高浓度组和一个较低浓度组中的上覆水、间隙水和沉积物样本进行测定;这些受试物质浓度的测定显示了水-沉积物系统中受试化学物质的行为和分布情况。试验开始时沉积物的取样可能影响试验(例如取走试验幼虫);因而，如果适当，在试验开始和试验期间要使用另外的试验容器来做取样测定(见10.3. 1. 2)。在可比较的条件下(例如沉积物与水的比率、应用种类、沉积物的有机碳含量)，如果在水/沉积物研究中，水和沉积物中受试物质的分布情况可以被清楚地测定，则不必再测量沉积物中的受试物
11、质浓度。10.3.1.2 当要做实验期间测量(例如第7d)，以及需要分析大量的样本时，样本的取出势必影响整个试验系统，此时应采用额外的试验容器;这些额外的试验容器在与正式试验容器相同的条件下进行处理(包括引入受试生物)，但不用来作生物学观察，仅用于从中进行取样分析。10.3. 1. 3 推荐用离心法分离间隙水，条件为:10 000 gCg为自由落体加速度值)、4oC、30min。但是，如果能够证实受试物不被吸附在过滤器上，也可以用过滤法。在一些情况下，几乎不可能分析间隙水的浓度，因为试样量太少了。10.3.2 理化参数用适当方法测量试验容器中的pH和温度(见第7章)。在试验开始和结束时，应测量
12、最高浓度的一个试验容器以及对照容器中的硬度和氨度。11 数据和报告11. 1 结果处理11.1. 1 本试验的目的是要测定受试物对摇蚊发育速率和完全羽化的雌雄蚊总数的影响，或者在为期10 d的试验中测定受试物对存活幼虫的数量和质量的影响。如果没有迹象显示摇蚊性别对统计灵敏GB/T 27858-2011 度存在差异时，则雌雄的结果可以合并统计。灵敏度差异存在与否可用统计方法判定，例如X2-rX 2 表检验。在为期10d的试验中，应测定幼虫存活数和每个容器中的平均个体干重。11. 1.2 根据试验开始时测得的沉积物中受试物浓度来计算效应浓度，效应浓度应以干态质量为基础。11. 1.3 为了计算EC
13、s。或其他ECx值，每个试验容器的统计数据值可当作真实的平行试验值。计算任何ECx的置信区间时，应考虑这些数值之间的偏差，或者要证明偏差小到可以忽略不计。当适用最小平方模式时，每个试验容器的统计数据值需通过转换来改善偏差的同质性。但计算EC值时，应将响应数据转换回原值。11.1. 4 为了测定NOEC/LOEC，当用假设检验法进行统计分析时，应考虑到每个试验容器的统计数据值的偏差，此时可用嵌套的ANOVA法;或者，当不符合通常的ANOVA法设定时，则需要进行更多更充分的试验呵。11. 2 羽化率11. 2. 1 羽化率是离散数据，当剂量效应关系预期为单向，并且这些数据也符合这一预期时，可用递减
14、的方法进行Cochran-Armi tage检验。否则，要使用Fisher精确检验或者Bonfeeroni-Holm修正值的Mantel-Haentzal检验。当相同浓度的平行试验的偏差比二项式分布更大(通常被称为外二项式偏差)，则应用充分的Cochran-Armi tage检验或者Fisher精确检验。11. 2. 2 每个试验容器中蚊的羽化总数饵，除以加入的幼虫的数量凡，即得羽化率，见式(1): 式中zER 羽化率;ne一一每个容器中羽化蚊的数量zn. 每个容器中加入的幼虫数。ER=主主且( 1 ) 11. 2. 3 当存在外二项式偏差时，最适合于大样本量的可选方法就是把羽化率当成一个连续
15、的效应值。当剂量-效应关系预期为单向，并且ER值也符合这一预期时，应用像William检验这样的程序;当剂量效应关系不保持单向时，则适用Dunnett检验。这里把大样本量定义为:在一个平行试验(一个容器)中，羽化数和未羽化数都超过5。11. 2. 4 使用ANOVA方法时，ER的值应该通过平方根-反正弦转换或Turkey-Freeman转换以获取一个近似正态分布并使方差齐性。当使用绝对频数时，可以应用Cochran-Armitage检验、Fisher精准(Bor出口oni)检验或Mantel-Haentzal检验。平方根-反正弦转换是对ER的平方根求反正弦(sina-1)值。11. 2. 5
16、使用回归分析计算羽化率EC(例如可使用probit2飞logit、Weibull或合适的商用软件等)。如果不能用回归分析(例如只有少于两个部分效应值)，则使用其他非参数方法比如移动平均或简单插补。11. 3 发育速率11. 3. 1 平均发育时间表示由从刚引人幼虫(试验第od)到大群实验性羽化成虫所跨越的平均时间(为了正确计算发育时间，应考虑幼虫引人时的虫龄)。发育速率(单位:l/d)是发育时间的倒数，表示每天羽化的幼虫的比率。对于评估沉积物毒性研究而言，发育速率更重要，因为与发育时间相比，它的偏差更低，更均一，更接近正态分布;因而更有效的参数检验程序可以用于计算发育速率而不是发育时间。因为发
17、育速率是一个连续效应值，EC值可以使用回归分析来估算22叫。11. 3. 2 对于下列统计检验，观察第z天所观察到摇蚊数量假定为从第z天到第x-L天(L=观察间隔的长度，通常为1d)中羽化而成。每个容器的平均发育速率(x)根据式(2)计算z7 GB/T 27858-2011 式中:王一一每个容器的平均发育速率;i一一观察间隔指数;m一观察间隔最大值;王二土主ffi一一观察间隔i中所羽化的摇蚊数量;ne 至实验最后阶段所羽化的摇蚊总数(=L.1i);Xi-一在观察间隔i中所羽化的摇蚊发育速率。11.3.3 在观察间隔i中所羽化的摇蚊发育速率Xi按照式(3)计算:Xi=呻z一专)式中:di一一观察
18、的天数(从加入幼虫起算的日期hL一一观察间隔i的长度(日期，通常为1d)。11. 4 试验报告11. 4. 1 受试物: ( 2 ) ( 3 ) -特性，相关的物理化学特性水溶性，蒸气压，土壤(或沉积物中)中的分配系数，水稳定性等J;一一化学识别信息(通用名、化学名、结构式以及CAS号等)，包括纯度和定量分析方法。11. 4. 2 受试生物:试验使用的生物的种类、学名、来源和饲养条件;一一处理卵块和幼虫方法的信息;-一-加入试验容器时受试生物的虫龄。11.4.3 检测条件:使用的沉积物，如:天然或人工配制的沉积物;对于天然沉积物，应记录沉积物取样地区的位置并作描述，如可能，还应包括污染史和天然
19、沉积物的特性:pH值、有机碳含量、碳氮比和粒度(如适用)。一一配制沉积物的制备z成分和特性(在试验开始前的pH值，有机碳含量，pH值，水分等); 一一试验用水的准备(如使用配制水)及其特性(在试验开始前的氧浓度，pH值，传导率，硬度等); 一一沉积物和上覆水的厚度;一一上覆水和间隙水的体积;沉积物分别含间隙水和不含间隙水的质量;一一试验容器(材料和尺寸); 储备液和试验浓度的制备方法;一一受试物质的使用:所用受试物质试验浓度，平行试样个数和使用的溶剂(若使用); 孵化条件:温度，光照周期和强度，通风(频率和强度); 一一喂养方面的具体信息包括饲料的种类、制备、喂养数量和喂养方案。11. 4.
20、4 结果z8 一一理论试验浓度，实际测量的试验浓度和决定试验容器中试验物浓度的所有分析结果;试验容器中水的质量，如:pH值，温度，榕氧量，硬度和氨度;一一如果在试验过程中对蒸发了的试验用水进行了补偿，则应记录;每天每个容器内成长为雄蚊和雌蚊的数量;每个容器内没能成长为摇蚊的幼虫的数量;GB/T 27858-2011 每个容器内单个幼虫的平均干态质量;如合适，测量每一龄虫的平均干态质量;一一每个平行试样和每个检测浓度的羽化百分率(雄蚊和雌蚊合计); -一每个试验容器中的完全羽化成蚊的平均发育率和处理率(雄蚊和雌蚊合计); 一估计毒性效应值，例如ECx(及其相关的置信区间)，NOEC和/或LOEC
21、，以及所用的统计方法;一一结果讨论，包括任何偏离该标准会对试验结论产生的影响。9 GB/T 27858-2011 A.1 摇蚊培养方法附录A(资料性附录)摇蚊培养方法推荐摇蚊幼虫的培养可以在沉积器皿或更大的容器中进行。在容器的底部铺上一薄层石英砂，厚度约5 mm 10 mm，也可以用硅藻土(如Merck，Art 8117)代替(厚度更薄，仅需几毫米就足够)。然后加入造用的水，水深数厘米。应补充蒸发损失，保持水位，防止干燥。如需要，可以更换水。还应提供温和的通风。摇蚊幼虫的培养容器外面应加一个笼子，以防止羽化后成虫的逃逸。笼子应足够大(至少30 cmX 30 cmX 30cm) ，这样成虫能成群
22、并交配。笼子应放置于室温下或温度为200C士2oC的恒温环境中16h光照(强度1000 lx) , 8 h黑暗。据报道，空气湿度(RH)小于60%会阻止摇蚊的繁殖。A.2 培养水任何适用的天然水或配制水都可使用。一般推荐使用井水、去氯的自来水和人工介质(如下述Elendt M4或M7勺。水在使用前应鼓氧。如需要，培养水可以用倾倒或虹吸法更换，应小心别损害到幼虫的管状巢。A.3 幼虫的喂食摇蚊幼虫用鱼食喂养(用TetraMin, Tetra Phyll或其他类似品牌鱼食)每天每笼大约250mg。可以给干的粉末或用水调配成悬浮液:1. 0 g碎鱼食加入20mL水混匀，每天每笼喂5mL这样的配制液(
23、使用前摇匀)。幼虫较大时可以适当多给些。按照水质调整喂食量，如果培养介质混浊，应减少喂食量。加食应小心调控。加食太少会导致幼虫向水柱迁移，加食太多会导致微生物繁殖快，水中氧气浓度下降。这两种情况都会使摇蚊幼虫生长变慢。当启用新的培养容器时，可以加一些绿藻(如Scenedesmussubs抖catus，Chlorella vulgaris)。A.4 成虫的喂食一些实验员推荐:将棉花球浸泡于饱和煎糖溶液后，作为羽化后成虫的食物。A.5 羽化在温度200C士2oC下，摇蚊幼虫在培养箱中大约13d15 d后就开始羽化成虫。A.6 虫卵成虫出现后，每周三次检查所有幼虫培养箱中凝胶状虫卵。如出现卵块，应小
24、心取出，转移到盛有10 GB/T 27858-20门培养液的小盆中。这些卵块将用于建立新的培养容器(每个容器加人2块4块卵块)或用于毒性试验。一龄摇蚊幼虫在2d3 d后孵化。A.7 新建培养箱一旦培养体系建立后，每周(或根据实验需要，延长新建周期)就能新建一个培养容器。当出现成虫后，就可以移去老的培养容器。使用这样的培养体系可以稳定高效地提供摇蚊成虫。A.8 介质M4和M7的配制Elendt(l990)已描述过介质M4。介质M7的配制与M4一样，只是某些物质的浓度只有M4的四分之一，参见表A.1。由于用以配制贮备溶液的Na2Si03.5H20、NaN03、KH2P04和K2HP04的浓度不够，
25、试验用溶液不能按照Elendt和Bias(l990)配制。A.9 介质M7的配制每一个贮备溶液(1 )单独配制，混合贮备液(1)由这些贮备溶液(1 )配制而成(参见表A.l)。将50 mL混合贮备液(II ) ，及表A.2中所列主要营养元素贮备液若干毫升，用去离子水稀释至1L，这样就配成了介质M7。按表人3将三种维生素加入到去离子水中，配制成维生素贮备溶液。使用前，在最终的M7中加0.1mL混合维生素贮备液(维生素贮备液应小份冷冻贮存)。介质应鼓氧并稳定。表A.l介质M4和M7微量元素贮备液配制混合贮备液CI):混合下试验溶液最终浓称取下列质列量(mL)的贮备液(1)并贮备液(l)量(mg)，
26、用去离用去离子水稀释至1L 度/(mg/U子水稀释至1L M4 M7 M4 M7 H3B03 57 190 1. 0 0.25 2: 86 o. 715 MnCl, .4H, O 7 210 1. 0 0.25 0.361 0.090 LiCl 6 120 1. 0 0.25 0.306 0.077 RbCl 1420 1. 0 0.25 0.071 0.018 SrCl, 6H, O 3040 1. 0 0.25 0.152 0.038 NaBr 320 1. 0 0.25 0.016 0.004 Na, MoO, 2H, 0 1 260 1. 0 0.25 0.063 0.016 CuCl
27、, 2H, O 335 1. 0 0.25 0.017 0.004 ZnCl, 260 1. 0 1. 0 0.013 0.013 CoCl, .6H, O 200 1. 0 1. 0 0.010 0.010 KI 65 1. 0 1. 0 0.003 3 0.003 3 Na, Se03 43.8 1. 0 1. 0 0.002 2 0.002 2 NH, V03 11. 5 1. 0 1. 0 0.000 58 0.000 58 Na, EDTA. 2H, O .b 5000 20.0 5.0 2.5 0.625 FeSO, 7H, O .b 1 991 20.0 5.0 1. 0 0.2
28、49 a这些物质在M4和M7中的差异，如上所示。b单独配制这些溶液，然后混合在一起立即高压灭菌处理。11 GB/T 27858一2011表A.2介质M4和M7主要营养元素贮备灌营养元素称取下列质量Cmg), 配制M4和M7介质贮备液主试验溶液M4和M7用去离子水稀释至1L 要营养素加入量/CmL/L)最终浓度/Cmg/L)CaC12 .2H20 29 380 1. 0 293.8 MgSO. .7H20 246 600 0.5 123.3 KCl 58000 o. 1 5.8 NaHC03 64800 1. 0 64.8 NaSi03 .9H20 50000 0.2 10.0 NaN03 27
29、40 o. 1 0.274 KH2 PO. 1 430 0.1 o. 143 K2 HPO. 1 840 0.1 o. 184 将三种维生素溶液混合，制备成一个维生素贮备液，见表A.3o表A.3介质M4和M7维生素贮备液维生素称取下列质量Cmg)，配制M4和M7介质贮备液主要M4和M7试验溶液最终浓度|用去离子水稀释至1L 营养素加入量/CmL/L)/Cmg/L) 盐酸硫胶(维生素B1)750 0.1 0.075 维生素B1210 0.1 0.001 0 维生素B77.5 0.1 0.000 75 12 B.1 沉积物组分附录B(规范性附录)制备配制沉积物配制沉积物的组分应符合表B.l要求。表
30、B.1配制沉积物的组分要求组成特征泥炭水苔泥炭;pH尽量接近5.5-6.0，无可见植物残余，细磨(颗粒尺寸:;lmm)并且风干石英砂粒度:颗粒在50m-200m范围的应大于50%高岭石粘土高岭石含量;?30%有机碳添加泥炭和砂来调整碳酸钙粉状CaC03(化学纯)水电导率:;10S/cmB.2 制备GB/T 27858-2011 沉积物干重百分比/%4-5 75-76 20 2土0.5。.05-0.130-50 泥炭风干后，磨至微细:粉末口用高性能均质化装置将置于去离子水中的一定量泥炭粉末制成悬浮液。用CaCOJ调整此悬浮液的pH值至5.5土0.5a在20.C:!:Z .C下，温和搅拌此悬浮液，
31、并陈化至少Z d，以稳定pH值，并建立稳定的微生物组分。再次测量pH值应在6.0土o.5。然后，将此泥炭悬浮液混入另外的组分(砂和高岭石粘土)和去离子水，获得均匀的沉积物。此沉积物水含量应在沉积物干重的30%50%范围内。此最终混合物的pH值需再次测定，并控制在6.57.5，需要时用CaC03调节。取沉积物样品，检测于重和有机碳含量。在作摇蚊毒性试验前，建议在与后续试验相同条件下将此配制沉积物陈化7d. B.3 贮存用来制备人工沉积物的干组分可以在室温下贮存在干燥阴凉的地方。配制沉积物(湿)在试验前不能贮存，应在7d陈化结束后立即使用。1 Q G/T 27858-2011 附录C(规范性附录)
32、稀释用水的化学特性要求C.1 稀释用水的化学特性要求见表C.L表C.1稀释用水的化学特性要求物质浓度颗粒物20 mg/L 总有机碳2 mg/L 未离子化的氨1g/L 硬度以碳酸钙计400 mg/L 残留氯10g/L 总有机磷农药50g/L 总有机氯农药十多氯联苯50问/L总有机氯25g/L a当硬离子和受试物有相互作用时，应使用低硬度水这种情况下，不能使用Eler由M4介质)。14 附录D(规范性附录)羽化同罩示意图GB/T 27858-2011 D.1 羽化网罩放置于试验烧杯上，从第20d到试验的最后应放置这些羽化网罩。所使用的羽化网罩示例见图D.L一一一一一-一一-E一一FA 尼龙筛网;D
33、一一-水交换筛网出人口zB一倒置的塑料杯;E一一水;C一)无边开口烧杯;F 沉积物。固D.1羽化罔罩示意图1; 牟MGB/T 27858-2011 参考文献lJ BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by悦Strelok巳andH. Kpp. Berlin 1995 2J R. Fleming et al. (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Wat
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