1、ICS 65.020.30 B 43 . tN;:.，:;:I昌中华人民共和国国家标准GB/T 31581-2015 牛性控冷冻精液生产技术规程Code of pratice 00 production of bovioe frozeo sexed-semen 2015-05-15发布2015-10-01实施hv飞，AJY沪产回中华人民共和国国家质量监督检验检费总局峪世中国国家标准化管理委员会a叩GB/T 31581-2015 前吉同本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由中华人民共和国农业部提出。
2、本标准由全国畜牧业标准化技术委员会(SAC/TC274)归口。本标准起草单位E农业部牛冷冻精液质量监督检验测试中心(北京、内蒙古赛科星繁育生物技术股份有限公司、北京奶牛中心、中国农业大学、全国畜牧总站、农业部牛冷冻精液质量监督检验测试中心南京。本标准主要起草人z张晓霞、李喜和、周文忠、刘海良、孙飞舟、张胜利、陆现希、杨清峰、武玉波、钱松晋、张海诗、刘玉、赵鹏、王建国、胡树香、张勇、胡志刚。I GB/T 31581-2015 牛性控冷冻精液生产技术规程1 范围本标准规定了牛性控冷冻精液生产的器械清洗和消毒、稀释液配制、采精、精液处理、精子分离、冷冻、解冻、检验、包装、贮存及运输。本标准适用于采用
3、流式细胞分离技术生产牛性控冷冻精撞。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本包括所有的修改单适用于本文件。GB 4143 牛冷冻精掖GB/T 5458 液氮生物容器GB/T 31582 牛性控冷冻精液NY/T 1234 牛冷冻精被生产技术规程3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1 精子分离sperm朋rting根据X精子和Y精子DNA含量的差异，利用流式细胞分离方法将X精子和Y精子分离开.3.2 性控冷冻精擅frozen sexed semen 分离后富含X精子或Y精子、经超低温冷冻后
4、在液氮中长期保存的精液。4 果精用晶清洗和消毒按照NY/T1234的规定执行。5 清谴配制与灭菌5.1 溶簸配制5.1.1 稀稀液稀释被配制见附录A中A.1.5.1.2 分离舰缓冲撞Tris-sh四th分离机缓冲破Tris-sheath的配制见A.2.1 GB/T 31581-2015 5.1.3 荧光染色谊和食品虹锦色渡荧光染色液和食品红染色液配制见A.3o5. 1.4 精子染色漳精子染色液的配制见A.4o5.1.5 精子收集灌精子收集液配制见A.5o5.2 溜班灭菌溶被在使用前进行高压蒸汽灭菌(120kPa.15 min).对于不能高压灭菌的溶液使用0.22m过滤器进行过滤除菌。6 主要仪
5、器设备流式细胞仪、精被分装机、细管印字机、程序冷冻仪、荧光显微镜、离心机、精子密度仪.7 果精按照NY/T1234的规定执行。8 精班处理精液处理方法按照NY/T1234的规定执行，精液分离前应添如抗生素并在18C -20 c的环境下保存，储存时间不超过16h. 9 精子分离9.1 分商环境精子分离实验室应保持洁净，室温控制在18C -25 C，元振动源。9.2 分离前处理根据所采原精密度，按比例进行染色。示倒s对4亿个精子进行染色，用染色原液稀释到2亿个/mL.加入15L-30LHochest 33342荧光染色液放入5 mL分离专用试管，混匀后放入34c水浴，加盖避光温育45mino再加入
6、2mL含4%卵黄的食品红染色液，最后制成精子分离样品.9.3 分商按照分离机操作规程分离。2 . GB/T 31581-2015 10 分离精灌冷冻10.1 稀辑平衡分离后的精液在4C士1C条件下平衡90min后同温1750g离心5min.去除上清液。然后用20%卵黄Tris-A液稀释收集后的分离精液，使精子密度注2000万个/mLo之后添加等量的含12%甘袖的Tris-B液，平衡20mino用1I 1的Tris-A液、Tris-B液将最终精子密度调整为注1000万个/mL。10.2 分装平衡后的精液在4C士1C条件下灌装、封口、印字，在细智上打印生产单位代号、品种、牛号、生产日期或批号见附录
7、B)、性控标记等信息。10.3 冷冻、包装在4C士1C条件下将分装后的细管按照棉塞同一方向码放在冷冻架上，然后移人冷冻仪中，冷冻的初冻温度调节至一90C，控制降温过程，在20min到达一120C后投入液氮中。冷冻结束后进行包装，包装应在一140c以下进行。保存性控冷冻精攘的液氮生物容器应符合GB/T5458的规定。11 入库前检查性控冷冻精液产品的质量应由专职的质量检验员负责检测，每批性控冷冻精液入库前应进行常规检验，方法见GB/T31582.检验合格后方可人库。12 贮存、运输按照NY/T1234的规定执行。3 GB/T 31581-2015 附录A(规范性附录牛性控玲冻精班生产相关溶渡配制
8、A. 1 溶攘配制试剂纯度应达到分析纯。A.1.1 Tris-A工作灌取TrizmaBase 35.32 g、拧攘酸17.21g、D-果糖12.65g溶于750mL双蒸水，搅拌30min，再加人双蒸水至1000 mL.溶液pH调到6.8，然后用0.22m的过撞器过滤除菌，5c士1c保存，有效期14 d. A.1.2 20%卵黄Tris-A渣取Tris-A工作液199mL，添加51mL卵黄掖，搅拌15min, 5 c士1C静置12h，去除沉淀，吸出表层卵脂后，在18500g的条件下离心，然后用0.22m的过滤器过滤除菌，加入抗生素，5c士1C保存，有效期7d。A.1.3 Tris-B工作班取Tr
9、izmaBase 35.746 g、拧攘酸19.980g、D-果糖14.712g溶于750mL双蒸水，搅拌30min，再加入双蒸水至1000mL。溶液pH调到6.8，然后用0.22m的过滤器过滤除菌，5c士1C保存，有效期14d。A.1.4 12%甘油Tris-B灌先用Tris-B工作被配制23%(体棋分数)卵黄液，搅拌15min后置5C士1c条件下12h析出沉淀。静置后吸出表层卵脂，并在18500g的条件下进一步离心沉淀。然后用0.22m的过谑器过撞除菌。再加人甘油使甘油终浓度达到12%(体积分数)。溶被pH调到6.8，加入抗生素，在5C士1C保存，有效期7d. A.2 分离机缓冲撞Tris
10、-sheath配制配制20L Tris-sheath工作液z取TrizmaBase 477.6 g、拧攘酸232.6g、D-果糖171.0g溶于3.0L 双蒸水中搅拌30min，并加盐酸把pH调到6.8，然后添加抗生素用0.22m的过撞器过滤灭菌，再加双蒸水至20.0L容量，调节pH至6.8，渗透压290mOsm士10mOsm.在5C士1C保存，有效期14d. A.3 荧光染色溜和食品缸挠色旗配制A.3.1 0.5%荧光染色擅将10mg荧光染料Hochest33342定容于2mL双蒸水中，在5C士1C条件下避光保存，有效期90 d. GB/T 31581-2015 A.3.2 5%食品红染色擅
11、将0.5g食品红染料定溶于10mL双蒸水中.0.22m过撞除菌，在5c士1C条件下避光保存。有效期为90d. A.4 精子染色糠配制A.4.1 精子揍色原班100 mL精子染色原液z依次称取HEPES0.925 g、氧化镜(MgClz 6Hz 0)0.008 g、氯化铀(NaCD0.5518 g、氧化饵(KCl)0.0224 g、磷酸氢二铀(NazHP04)0.004 g、碳酸氢锵(NaHC03)0.084g、丙酣酸铀0.022g、葡萄糖0.09g、乳酸锅0.361mL、BSA0.3 g.溶于100mL双蒸水中，调整pH至7.4.加入0.25 mL庆大霉素(10mg/ mL) .0.22m过滤
12、灭菌后，在5C士1C保存，有效期为7d., 10 d。A.4.2 含4%卵黄的食品虹染色液A.4.1中100mL精子染色原攘，加人0.261mL食品红染色液，形成食品红染色液。取96mL食品红染色液添加4mL卵黄，搅拌后在5C条件下静置12儿去除卵黄颗糙沉淀，18500g离心30min. 调整pH至5.5.然后加入0.25mL庆大霉素(10mg/mL).经过0.22m过滤灭菌，在5C士1C保存，使用期限为14d. A.5 精子收集溃配制取20%卵黄Tris-A液100mL.加人16mL双蒸水，充分摇匀.5 c士1C保存，有效期7d. 5 GB/T 31581-2015 附录B(规范性附录)细管
13、性控冷冻精谛标记方法细管性控冷冻精液标记由20个字符、5个部分组成，每部分之间空开2个字符位置，排列顺序如下z医直到1-=*1 匿主团匿画圈1_1i*1 生产单位代号品种代号公牛注册号生产日期性控标记三个字符二个字符五个字符六个字符四个字符第一部分公牛站代号以农业部公布的公牛站代号为准参照NY/T1234标准执行);第二部分品种代号以GB4143为依据z第三部分公牛号取诙牛身份证号码的后五位数s第四部分冻精生产日期六位数按年、月、日次序排列，年、月、日各占二位数F第五部分性控标记z性控或XK，X为雌性，Y为雄性。每部分之间间隔2个字符位置。标记的字迹应清晰易认。示倒sl 棉寒封口端x X X
14、HS X X X X X X X X X X X XK-X 国XXX为生产单位代号，HS为荷斯坦公牛的品种代号，XXXXX为该公牛身份证号码的后五位数，XXXXXX为20XX年XX月XX日的生产日期，XK-X代表性控X精子。6 、.的FON|户的FmH筒。华人民共和国家标准牛性控冷冻精镀生产技术规程GB/T 31581-2015 国中* 中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100029)北京市西城区三里凋北街16号(10004日网址总编室:(010)68533533发行中心:(010)51780238读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销李印张0.75字数14千字2015年6月第一次印刷开本880X1230 1/16 2015年6月第一版* 可i:155066.1-51984 16.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107定价
