1、ICS 65.020.01 B 16 中华人民共和国国家标准GB/T 31787-2015 香石竹环斑病毒分子生物学检测方法Molecular detection of Carnation ringspot virus 2015-07-03发布2015-11-27实施矶、，.t:13 . Jv:K F 、飞主与-:也，知何忡W岳阳时扫雪l II.J,中华人民共和国国家质量监督检验检菇总局串舍中国国家标准化管理委员会。叩GB/T 31787-2015 前占百本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。本标准起草单位z中华
2、人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国天津出入境检验检疫局、上海市标准化研究院、中华人民共和国珠海出人境检验检疫局.本标准主要起草人E揭翠云、于翠、魏亚东、杨瑞钮、张卫东、郭京痒、胡培龙、崔学慧。I GB/T 31787-2015 香石竹环斑病毒分子生物学检测方法1 范固本标准规定了香石竹环斑病毒的RT-PCR，IC-RT-PCR和实时荧光RT-PCR等分子生物学检测方法。本标准适用于植物种苗中携带的香石竹环斑病毒的检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单适用于本
3、文件。SN/T 1193 基因检验实验室技术要求SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样3 仪器设备、用具和试剂3. 1 仪器世备PCR仪、实时荧光定量PCR仪、超净工作台、电子天平(1/10000 g)、电泳仪、电雄槽、凝胶成像系统、水浴锅、高速冷冻离心机、-80.C超低温冰箱、高压灭菌锅、制冰机、微波炉、被涡振荡器。3.2 用具可调式微量移液器(2L、10L、100L、200L、1000L)及相应的无RNase吸头、无RNase离心管、PCR管和研钵等.3.3 试剂RT-PCR试剂(见附录B)，IC-RT-PCR试剂见附录C)。4 症状观察及抽样4.1 症状观察现场检疫主要观察进境
4、植物材料上病毒为害的症状，CRSV为害症状描述参见附录A。4.2 抽样发现有病毒为害症状的植物材料直接送栓z未发现症状的，则按SN/T2122中规定进行抽样，并送实验室进行病毒检测鉴定。5 捕毒栓副5.1 RT-PCR方法将送捡植物样品中有疑似病毒为害症状的植物组织液氮研细，取0.1g用于提取植物总RNA，然后GB/T 31787-2015 反转录获得cDNA，再进行PCR反应。具体操作步骤见附录B.5.2 兔擅捕藐RT-PCR方法CIC-RT-PCR)将送检样品中有疑似病毒为害症状的植物组织放人研钵内研磨，并按重量和病毒抽提缓冲液1 : 10的比例稀释，制备的汁液分别盛装于离心管中，离心后吸
5、取上清液作为待测样品。用香石竹环斑病毒抗血清包被PCR管，洗涤后在PCR管中加入制备的待测样品，进行免疫捕获，然后反转录获得cDNA，再进行PCR反应。具体操作步骤见附录C。5.3 实时荧光RT-眈R方法采用5.1或者5.2方法获得cDNA，进行实时荧光PCR反应。具体操作步骤见附录D.6 防污染措施香石竹环斑病毒分子生物学检测过程的防污染措施应符合SN/T1193的规定。制样用的研钵经过洗涤液清洗后，160.C干热处理2h. 7 结果判定样品经RT-PCR、IC-RT-PCR和实时荧光RT-PCR三种方法之一检测为阴性时，证明样晶不携带香石竹环斑病毒。样品经RT-PCR或IC-RT-PCR检
6、测为阳性，需要进行序列测定，如果序列测定结果证实与所检测的香石竹环斑病毒一致，可判定样品携带香石竹环斑病毒。样品经实时荧光RT-PCR检测为阳性时，也可判定样品携带香石竹环斑病毒。8 梓晶保存和结果记录8.1 样品保存经检测确定携带香石竹环斑病毒的样品，应妥善保存在-80c冰箱中。并做好登记和标记工作，保存期满后，需经灭活处理。8.2 结果记录记录包括z样品来源、种类、取样人员、实验的时间、地点、方法和结果、检验检疫员的签字等。RTPCR和IC-RT-PCR检测应有电泳结果照片及序列测定分新结果，实时荧光RT-PCR应有荧光曲线图与Ct值。2 附录A(资料性附录香石竹环斑病毒背景资料A.1 背
7、景资料A.1.1 香石竹环斑病毒基本信息中文名z香石竹环斑病毒。学名:Carnation rings pot virus 0 缩写:CRSVoGB/T 31787-2015 分类地位z番茄丛矮病毒科CTomhusviridae).香石竹环斑病毒属(Dianthovirus)。传播途径z该病毒通过无性繁殖材料的运输进行长距离传播，近距离主要是由于植物间的接触、土壤污染和农事操作等引起病毒传播。尚未见种传报道。A.1.2 方法原理用特异性抗体吸附待测样品中的病毒粒子后经高温裂解释放出病毒RNA.或直接从待测样品材料中提取植物总RNA.然后在逆转录酶的作用下合成cDNA.cDNA为模板再通过普通PC
8、R或实时荧光PCR进行检测。分析PCR结果即可明确材料中是否含有香石竹环斑病毒的核酿成分。A.2 寄主范围香石竹环斑病毒的实验寄主范围较自然寄主广，在自然条件下，CRSV主要侵染香石竹，还可侵染李树、梨树、苹果、葡萄、酸樱桃和甜樱桃等多种果树及果园里的杂草，如z黛缕。在实验条件下.CRSV可侵染25科共133种植物，可系统侵染茄科、豆科和葫芦科的植物，非系统侵染的寄主范围更广。A.3 为曹症状CRSV侵染香石竹引起叶片环斑、斑驳，导致叶和花的扭曲及畸变，严重可致叶尖坏死。当CRSV与香石竹斑驳病毒(Carnationmoule virus)共同侵染时，症状加重oCRSV侵染果树的症状较轻且很难
9、发现。CRSV接种如下几种鉴别寄主可产生相应的症状，可用来作为该病毒的鉴定方法之一。宽色葱(Chenopodiumamaranticolor)和昆诺寨(C.quinoa):接种叶出现局部褪绿或坏死斑，通常无系统症状.三生烟(Nicotianatabacum var.Samsun NN) I接种叶出现退绿环斑、枯斑及坏死斑，后期病斑连成片。虹豆(Vignaunguiculata ssp.Sinensis):接种叶产生局部坏死斑，接着系统感染叶产生斑驳、坏死斑、叶片卷曲或脉缩。美国石竹(Diathusbarbatus) :接种叶产生环状病斑，接着为系统褪绿及坏死斑。千日红(Gomhrenaglob
10、osa) :接种叶产生局部坏死环斑，接着系统感染叶产生病斑、斑驳和畸形。莱豆(Phaseolusvulgaris) :接种叶产生局部坏死斑，接着叶变白、坏死，产生不规则系统斑，坏死叶GB/T 31787-2015 脉斑，最后无症带毒。番杏(Tetragoniaexpansa):接种后叶片产生局部白斑，有时也产生系统坏死斑。A.4 分布欧洲z丹麦、芬兰、法国、德国、意大利、立陶宛、荷兰、波兰和英国。美洲z巴西、加拿大、哥伦比亚、墨西哥和美国。大祥削z澳大利亚和新西兰。A.5 病毒粒体形态病毒位体为直径34nm的正二十面体(T=剖，由180个分子质量为37900u的蛋白亚基组成病毒桂子外壳.A.6
11、 基因组基因组由RNA-l和RNA-2两条单链RNA分子组成，分别为3.8kb和1.4恼。RNA-1在缺少RNA-2时可单独在植物原生质体中进行复制，但侵染植物需RNA-1和RNA-2的共同作用。4 B.1 试剂B. 1. 1 RNA提取试剂附录B(规范性附录RT-PCR方法Trizol裂解液、三氯甲烧、异丙蹲、75%乙醋。B.1.2 反转录试剂GB/T 31787-2015 AMV反转录酶(5U/L)、5XAMV酶缓冲被、dNTPOOmmol/L)、RNA酶抑制剂(40U/L) B. 1.3 PCR试剂10XPCR缓冲液、氧化镜(25mmol/L)、dNTPOQmmol/L)、TaqDNA聚
12、合酶(5U/L)。B. 1.4 50 X TAE Tris 冰乙酸0.5 mol!L EDTA 用时加蒸馆水稀释至lXTAEoB.2 实验步骤B.?.l sI物序3日j242 g 52.1 mL 100 mL 上游引物ICRSV-F:5-CCGATGTGCCCAAGTATGT-3; 下游引物，CRSV-R，5 -GGCTATGACGCCGTGAAT-3 , J 扩增片段长度406忡。B.2.2 RNA提取取适量待测样品液氮研细，然后取0.1g磨碎的样晶放入1.5mL离心管中，加入1mL Trizol，棍匀F加入0.2mL三氯甲饶，猛烈振荡15s ,4 C 11 000 r/min离心10min
13、.小心吸取上层无色水相到新离心管中，加入等体积异丙晖，混匀，一20C静置10min.4 c 12 000 r/min离心15min，保留沉淀s加入1mL 75%冷乙晖，悬浑沉淀.4C 8000 r/min离心10min.干燥沉淀g加人30LDEPC-H20.榕解沉淀(必要时，55C60 C水浴10min.加速榕解).存于一80c备用。或者按照植物总RNA提取试剂盒说明书进行操作。B.2.3 反转录反应体系及反应条件见表B.1.试剂加样量可根据具体情况进行适当调整。也可采用RT-PCR一步法试剂盒，操作步骤按使用说明进行。5 GB/T 31787-2015 表B.1反转录反应体系与反应条件名称储
14、存浓浓度终浓度加样量/L下部引物20mol/L 1.0mol/L 1 RNA 2 HzO 8 上述混合物于70-C，温育5min;立即置于冰上.1min，.1JD人下列试剂.缓冲液5X 1X 4 dNTP 10 mmol/L 1.0 mmol/L 2 RNA酶抑制剂40 U/L 2 U/L 1 AMV 5 U/L 0.5 U/L 2 总体积20 反转录反应条件:42C ,50 min;85 -C ,5 min立即置于冰上，此时得到的是病毒cDNA.如不立即进行PCR扩增，应将反转录产物置于一20C保存.B.2.4 核酸扩增PCR反应体系见表B.2，每个样品设2个平行处理。反应体系中各试剂的量可
15、根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。检测时以含香石竹环斑病毒材料的cDNA或含有香石竹环斑病毒材料目标片断的质位作为阳性对照，以健康植物材料尽量与所检测样品一致)cDNA作为阴性对照，以水代替模极作为空白对照。PCR反应条件设置如下194C 3 min;94 C 30 8、52C 30 8、72C 30 8，30个循环，72C 10 min 延伸。表B.2PCR反应体系试剂名称终浓度10XPCR反应缓冲液lX I MgClz 2.0 mmol/L dNTP 0.2 mmol/L 上游引物0.2mo1/L 下游号l物0.2mol/L Taq DNA聚合酶1.5 U DNA模扳2L 补Hz
16、O至25L B.2.5 琼脂精凝肢电琼撞测用lXTAE配制1.5%琼脂糖凝胶，加热溶化后冷却至55C左右F将漠化乙键(EB)加入到配制好的凝肢中，EB终浓度为0.5g/mL。将凝肢倒入凝胶槽中，插上样晶梳子。冷却凝固后拔掉梳子，在电泳槽内加入1XTAE，缓冲液要渡过凝胶表面约1mm;将加样缓冲液与样品混合后加人样品孔，并加入GB/T 31787-2015 分子质量标准物(Marker)J接通电源，以3V/cm.5 V/cm电场强度进行电禄，0.5h后观察结果，将整个凝胶置于凝胶成像系统上观察，记录结果。B.2.6 结果判定通过观察，阳性对照出现406bp条带，阴性和空白对照不会出现相应条带，此
17、时如果检测样品呈现相应条带应被判为阳性，否则应被判为阴性。如果是阳性可通过测序的方式进一步确认。如果PCR产物序列与香石竹环斑病毒的序列同源，则可判定样品为香石竹环斑病毒阳性，若序列不同源，则可判定样品为香石竹环斑病毒阴性.7 GB/T 31787-2015 附录C(规范性附录)免瘦捕获RT-PCR方法(IC-RT-PCR方法C.1 试剂C.1.1 CRSV抗体C.1.2 反转录试剂AMV反转录酶(5U/L)、5XAMV酶缓冲液、dNTPOOmmol/L)、RNA酶抑制剂(40U/L)。C.1.3 包被缓冲撞(pH9.6) 碳酸销(Na2COS)1.59 g 碳酸氢铀(NaHCOs)2.93
18、g 叠氮铀(NaN3)0.2 g 溶于蒸馆水中，并用蒸馆水定容至1L. C.l.4 P即r缓冲撞(pH7.4) 氧化锅(NaCl)磷酸二氢饵(KH2P04)磷酸氢二铀(Na2HP04 12H20) 氧化饵(KCl)叠氮铀(NaNs)吐温20(Tween-20) 溶于蒸馆水中，并用蒸锢水定容至1L. C.1.5 样晶抽提缓冲谛(pH7.4) 8.0 g 0.2 g 1.15 g 0.2 g 0.2 g 0.5 mL 亚硫酸铀(Na2S03)1.3 g 囊乙烯基毗咯烧圆(PVP)20 g 榕于PBST中，并用PBST定容至1L。C.2 实瞌步骤C.2.1 引物序列见B.2.1.C.2.2 抗体眼附
19、将CRSV抗体用包被缓冲液作适量稀释，吸取200L包被PCR管，37C，孵育2h;用PBST洗3次，取样品50mg，加入样品抽提缓冲液进行研磨，吸取100L包被PCR管.4C过夜(或37C.孵育2 h) ，PBST搅3次，DEPC-H20洗1次，短暂离心后吸去管底余液。8 GB/T 31787-2015 C.2.3 反转录直接在吸附了病毒的PCR管中进行反转录。反转录体系总体积20L.其中1L反向引物(20mol/L) .4L5XAMV晦buffer.2LdNTPC1 0 mmol/L) .10LDEPC-HzO.稍离心混匀后，置85 C变性5min.迅速置冰上2min3 min.然后加人2L
20、AMV反转录酶(5U/L).1LRNA酶抑制剂(40U/L) .42 C反应1h. C.2.4 PCR扩捕和琼脂楠凝肢电琼检测操作方法见B.2.4和B.2.5.C.3 结果判断通过观察，阳性对照出现406bp条带，阴性和空白对照不会出现相应条带，此时如果检测样品呈现相应条带应被判为阳性，否则应被判为阴性。如果是阳性可通过测序的方式进一步确认.如果PCR产物序列与香石竹环斑病毒的序列同源，则可判定样品为香石竹环斑病毒阳性，若序列不同源，则可判定样品为香石竹环斑病毒阴性。9 GB/T 31787-2015 附录D规范性附录实时荧光RT-配R方法D.l 实验步骤D.l.1 引物和探针序列引物序列z上
21、游引物:CRSV-F-163: 5人TTACCTGGCGCGCACT ATT-3 J 下游引物:CRSV-R-163: 5人GCTCTTGAGTATGAGAGCAAG-3 ; 探针序列:F AM-5 CAGCAACCAGAACCG 3 -T AQMAN-MGB. D.1.2 cDNA合成可通过对样品进行RNA提取，再反转录获得cDNA，操作方法见B.2.2和B.2.3;也可以通过抗体吸附样品中的病毒粒子，直接反转录在得cDNA，操作方法见C.2.2和C.2.3.D. 1.3 实时荧光PCR反应体系实时荧光PCR反应体系见表D.1，每个样品设2个平行处理。并设阳性对照、阴性对照和空白对照，以含有
22、香石竹环斑病毒的cDNA为阳性对照自以健康植物材料的cDNA作为阴性对照，以水代替DNA模板作为空白对照。每种对照各做2个平行管。表D.1实时荧光PCR反应体系试剂名称终浓度,1 10XPCR反应缓冲浓lX MgClz 3.0 mmol/L dNTP 0.2 mmol/L 上都引物0.4mol/L 下游引物0.4mol/L Taq DNA聚合酶lU 探针0.24mol/L DNA模板1L 补H20至25L D. 1.4 实时荧光PCR反应参数反应条件z预变性94c 10 min, 94 C 15 5, 60 C 405, 72 C 405，共40个循环。本反应条件适用于ABI7500型荧光PC
23、R仪，如使用其他荧光PCR仪，可根据仪器性能进行适当调整。操作方法按照仪器的使用说明进行，反应结束后保存各项数据和图像.GB/T 31787-2015 D.2 锚果判定D.2.1 阔值设定阔值设定根据仪器噪音情况进行调整，或以阔值钱刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点，结果显示阴性为准。D.2.2 质搜标准阳性对照的Ct值应30.0，并出现典型的扩增曲线。否则，此次实验结果无效。阴性对照和空白对照无Ct值.D.2.3 结果判定在阳性样品和阴性样品Ct值正确的情况下，进行以下判定z一一待测样品的Ct值为40或无Ct值时，则判定结果阴性s一一待测样品的Ct值小于或等于35时，则判定结果阳性p待测样
24、品的Ct值小于40而大于35时，应重新进行测试，如果重新测试的Ct值为40时，则判定结果阴性。如果重新测试的Ct值小于40而大于35时，则判定结果阳性。巴ONlhhFmH阁。华人民共和国家标准香石竹环斑病毒分子生物学检测方法GB/T 31787-2015 国中* 中国标准出版社出版发行北京市割阳区和平里西街甲2号(100029)北京市西城区三里河北街16号(10004日网址总编室:(010)68533533发行中心:(010)51780238读者服务部1(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销 开本880X 1230 1/16 印张1字数21千字2015年8月第一版2015年8月第一次印刷* 18.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107号:155066. 1-49766定价
