1、ICS 65.020.01 B 16 中华人民共和国国家标准GB/T 31797-2015 啤酒花潜隐类病毒检疫鉴定方法Detection and identification of Hop latent viroid 2015-07-03发布2015-11皿27实施f飞中华人民共和国国家质量监督检验检瘟总局啦舍中国国家标准化管理委员会a咽GB/T 31797-2015 前-眉目本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。本标准起草单位z中华人民共和国宁波出入境检验检疫局、中华人民共和国北京出入境检验检疫局、中华人民共
2、和国新疆出人境检验检疫局、中国农业科学研究院植物保护研究所、石测子大学。本标准主要起草人z郭立新、邓丛良、段维军、张祥林、李世访、姜冬梅、荣德福、刘升学。I GB/T 31797一2015啤酒花潜隐类病毒检疲鉴定方法1 范围本标准规定了啤酒花潜隐类病毒的检疫鉴定方法。本标准适用于啤酒花(Humulusluulus)及其无性繁殖材料、种子、花粉上啤酒花潜隐类病毒的检疫鉴定，同时也适用于牵草(Humulusjaonicus)和异株尊麻(Urticadioica)上啤酒花潜隐类病毒的检疫鉴定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡
3、是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法3 仪器设备、主要用具和主要试剂3.1 仪器设备电子天平(感量0.001g)、普通天平(感量0.1g)、高速冷冻离心机、小型瞬时离心机、普通冰箱、越低温冰箱(-80C)、制冰机、涡旋振荡器、磁力搅拌器、高压灭菌锅、pH计、PCR仪、微波炉、电泳仪、电泳槽、凝胶分析成像系统、实时荧光PCR仪、杂交炉、塑料薄膜封口机、紫外交联仪、暗箱、摇床、可调移被器(2.5L，10L，20L，200L.1000L.5000L)。3.2 主要用具无RNase吸头(10L.20L，200L，l000L，
4、5 000L)、无RNase离心管(1.5mL, 5 mL, 10 mL)、研钵、研棒、磁性分离架、PCR反应管(200L)、实时荧光96孔反应板、杂交瓶、杂交膜、杂交袋、X光片。3.3 主要试剂除另有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中相关规定。RT-PCR检测试剂见附录B;实时荧光RT-PCR检测试剂见附录C，斑点杂交检测试剂见附录D.4 栓副样晶制备4.1 种子类随机抽取至少50粒种子样品，进行表面消毒后，置于铺有吸水纸的白瓷盘或培养皿中，在适宜的发芽温度条件下催芽，直至长出第一对真叶发芽时间大约一周)，或者在消毒的土壤中直接种植，直至长出第一对真叶。取适量叶片，
5、放入洁净的研钵中，加人液氮后迅速研磨成细粉状。1 GB/T 31797-2015 4.2 种菌类对于有症状的种苗类样品选取全部表现症状种苗类样品的叶片，对于无症状的种苗类样品选取适量样品的叶片，放人洁净的研钵中，加被氮后迅速研磨成细精状，5 幢测与鉴定5.1 试验设计每个样品设置两个平行反应。检测时以感染啤酒花潜隐类病毒的植物组织作为阳性对照，以健康植物组织作为阴性对照，以双蒸水代替模板作为空白对照.5.2 普通RT-PCR方法普通RT-PCR方法见附录B.5.3 实时荧光RT-PCR方法实时荧光RT-PCR方法见附录C。5.4 斑点杂吏方法斑点杂交方法见附录D.6 结果判定样品经普通RT-P
6、CR检测为阳性，且实时荧光RT-PCR检测为阳性或斑点杂交检测为阳性，则判定为检出啤酒花潜隐类病毒。样品经普通RT-PCR检测为阳性，且序列测定结果与己知的HpLVd序列一致，则判定为检出啤酒花潜隐类病毒。7 结果记录与样晶保存7.1 结果记录与资料保存完整的实验记录包括z样品的来源、种类、时间，试验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员和审核人员签字。普通RT-PCR检测结果保存电泳照片，实时荧光RT-PCR检测结果保存荧光曲线图及Ct值，斑点杂交检测保存照片，序列测定结果保存测序报告图。7.2 梓晶保存与处理样品经登记人和经手人签字后妥善保存3个月，种子保存在干燥条件下或4C冰箱内，生
7、长苗木保存在隔离温室中，其他繁殖材料可取实验样品在一80C冰箱内保存。对检出啤酒花潜隐类病毒的样品应至少保存6个月，以备复检、谈判和仲裁。保存期满后，应灭活处理。2 . GB/T 31797-2015 A.1 背景资料A. 1.1 啤酒花潜隐类病毒基本信息学名:Holatent町roid.缩写:HpLVd。附录A资料性附录)啤酒花潜睡类病毒相关资料分类地位z马铃薯纺锤形块茎类病毒科(Pospiviroidae)、椰子死亡类病毒属(Cocadviroid)。A.1.2 方法原理反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、实时荧光RT-PCR反应及斑点杂交方法是本标准制定的主要依据。A.2 寄主拖围Hp
8、LVd寄主范围较窄，仅侵染啤酒花(Humulusluulus)、牵草(Humulusjaponicus)和异株尊麻(Urtica dioica). A.3 病害症状寄主受HpLVd侵染后一般不表现症状，但在英国，啤酒花Omega品种受HpLVd侵染后，出现萎黄、生长缓慢及球果较小等症状.A. 4 分布地区欧制z比利时、捷克、英国、法国、德国、匈牙利、波兰、葡萄牙、俄罗斯、西班牙、南斯拉夫。亚制z日本、韩国、中国新疆。美制=巴西、美国。非溯z南非。大洋洲z澳大利亚。A.5 传播方式HpLVd主要通过无性繁殖材料、农事操作工具进行传播F也可通过种子(8%传毒率、花精传播，但传毒率很低自至今尚无昆虫
9、介体传播的报道。A.6 基因组HpLVd的基因组为一条环状单链RNA，长256时，具有5个功能区，形成稳定的棒状二级结构。HpLVd通过不对称液环模式进行复制，基因组不编码蛋白质。3 GB/T 31797-2015 附录B规范性酣录普通RT-PCR幢副方法B.1 主要试剂B.1.1 1 mol/L磷酸氧二锦(K2HP04)磷酸氢二拥17.42 g 加双蒸水定容至100mL.用0.22m雄膜过滤除菌或高压蒸汽灭菌。B.1.2 2.5 mol/L磷醋氧二饵(K2HP04)磷酸氢二饵43.55 g 加双蒸水定容至100mL。用0.22m撼膜过撞除菌或高压蒸汽灭菌。B.l.3 3 mol/L Z酶铀(
10、NaAc)(pH 5.2) 主水乙酸铀40.83 g 用3mol/L乙酸调节pH至5.2。用双蒸水定容至100mL.高压蒸汽灭菌。B. 1.4 4 moI/L氧化组(LiCl)氯化钮16.96 g 加双蒸水定容至100mL.用0.22m滤膜过滤除菌或高压蒸汽灭菌。贮存于4C。B.1.5 研磨缓冲液异硫氧醺腻(GITC)十二烧基肌氨酸铀曲拉通X-100(TritonX-100) 氯化铀(NaCD拧攘酸铀缓冲液(pH7.0) 聚乙烯毗咯烧酣(PVP)B.1.6 50 X TAE罐冲撞Tris碱冰乙酸4 mol/L 5 g/L 0.1%(体积分数10 mmol/L 25 mmol/L 20 g/L
11、242 g 57.1 mL 乙二胶四乙酸(EDTA)(0.5 mol/L,pH 8.0) 100 mL 加双蒸水定容到1L。B.l.7 6 X Loading援冲撞澳酣兰2.5 g/L 二甲苯青FF2.5 g/L 藤糖水榕液400 g/L 4 GB/T 31797-2015 贮存于4C。B.2 吉l物序列正向引物HLVdF:5-ATACAA CTC TTG AGC GCC GA -3;反向引物HLVdR:5-CCACCG GGT AGT TTC CAA CT -3 ;扩增片段大小为256bp. B.3 试验步骤B.3.1 RNA的提取B.3.1.1 方法一B.3.1. 1. 1 取1g样品，加
12、液氮研磨成粉末状，将研磨物迅速移入10mL离心管中，并加人2mL 1 mol/L 磷酸氢二饵和8pL琉基乙酶，混句，再加入2mL水饱和酷=三氯甲烧(体现比1: 1)，充分混匀，4C , 10000 g离心10min. B.3.1. 1.2 取上层液体，加入同体棋的水饱和酣E兰氯甲烧体相比1: 1)，充分混匀刊C，10000 g离心10min. B.3.1.1.3 取上层液体，加人2.5倍体积的无水乙晖，充分混匀;-20C下放置2h.4h或-80C下放置至少30min;4 C, 10 000 g离心10min. B.3.1.1.4 取沉淀，加1mL无RNase的水充分榕解后，再加人1mL 2.5
13、 mol/L磷酸氢二钢、1mL的乙二蹲单甲醺(即:2-甲氧基-乙醇)，充分混匀;4 c , 10 000 g离心10min. B.3. 1. 1.5 取上层液体，加入元RNase的水至10mL，再加入100L20 g/L的十六烧基三甲基澳化镀(CTAB)榕攘，充分混句，冰浴3h-4 h ,4 C , 10000 g离心10min. B.3. 1. 1.6 取沉淀，加入2mL无RNase的水充分溶解后，加入5mL无水乙蹲、0.2mL 3 mol!L乙酸铀(pH5.2)，充分混句，-20C下放置至少2h;4 C , 10000 g离心10min. B.3. 1. 1.7 取沉淀，加200L无RNa
14、se的水反复吹打，待沉淀充分溶解后，将溶解物移人1.5mL离心管中z加入200L4 mol/L氯化锤，充分混匀，冰潜至少4h;4 C , 10000 g离心10min. B.3. 1. 1.8 取上层液体于1.5mL离心管中，加入2.5倍体积的无水乙蓝事，混匀，-20C下放置至少2h 或-80C下放置至少30min;4 C. 12 000 g离心10min. B.3.1. 1.9 取沉淀，70%乙蹲清跪沉淀，4C .12000 g离心2min;取沉淀，待其干燥后，加入50L. 60L无RNase的水充分海解，-20c下保存备用。B.3.1.2 方法二B.3.1.2.1 取0.1g样品，加液氮研
15、磨成粉末状，将研磨物迅速移入1.5mL离心管中，加入1mL Trizol Reagent，颠倒混句，2C -8 c .12000 g离心10min。B.3. 1.2.2 取上清攘，15C .30 C，放置5min;加入0.2mL三氯甲雄，用手剧烈振荡勿涡旋振荡)约15 s. 15 C .30 C，放置2min.3 min, 2 C8 c .12 000 g离心15min. B.3.1.2.3 小心吸取约为600L的上层水相，勿扰动中间相和下层相。加500L异丙酶混合上清液，15 c .30 C.放置10min. 2 C .8 C, 12 000 g离心10min. B.3.1.2.4 去除上清
16、液，沉淀中加人1mL 75%乙酶，洗涤;2.C.8 C.7 500 g离心5min. B.3.1.2.5 去除上清液，沉淀自然干燥后，将其椿于30L.50L元RNase的水中。B.3.1.3 方法三B.3.1.3.1 取0.05g样品，加液氮研磨成粉末状，待研磨物温度升到室温，加入2.5mL的研磨缓冲液，GB/T 31797-2015 继续充分研磨，将研磨物移入5mL的离心管，4C , 5000 g离心5min，留上清液备用。B.3.1.3.2 取2mg纳米磁珠于1.5mL的离心管中，离心管置于磁性分离架上，吸附纳米磁珠，弃上清鞭。B.3.1.3.3 向含有纳米磁珠的离心管中加入800L备用上
17、清被.用枪反复吹打至没有明显结块。B.3. 1.3.4 再向离心管中加人400L元水乙踵，颠倒混匀，室温放置5min-10 min，放置期间颠倒混句几次。将离心管瞬离后，置于磁性分离架上，吸附纳米磁珠，弃上清液.B.3.1.3.5 向离心管中加入150L70%的乙晖，用枪吹打混匀，将离心管置于磁性分离架上，吸附纳米磁珠，弃上清攘，并重复2次.5次，至上清被没有明显颜色。B.3.1.3.6 将离心管瞬离后，置于磁性分离架上，吸附纳米磁珠，完全弃除上清液。向离心管中加入约50L元RNase的水，用枪反复吹打重新悬浮纳米磁珠，室温放置2min-5 min. B.3.1.3.7 将离心管置于磁性分离架
18、上，吸附纳米磁珠，将含有RNA的上清液转移至一无RNA酶污染的离心管中，-80C冰箱保存备用。注IRNA也可使用相应市售RNA提取试剂盒提取.B.3.2 RT-PCR 在25L反应体系中加入2.5L10XRT-PCR缓冲液，5LMgClz (25 mmol/L) .2.5LdNTP Mixture (各10mmol/L). 0.5L RNase Inhibitor(40 U/L) .0.5L AMV RTase XL(5 U/L) , 0.5LAMV-Qtimized Taq(5 U/L).0.5L引物HLVdF(20mol/L), O. 5L引物HLVdR(20mol/L) .1L RNA,
19、RNase Free dHzO补至25L。反应条件为:50C 30 min.94 C 2 min，然后94 C 30 s,55 C 30 s ,72 C 30 s.共35个循环，72C 5 min. 注z反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整.也可采用其他商业RT-PCR试剂盒.B.3.3 PCR产物的琼脂精摄股电泳灌制2%琼脂糖凝肢板，室温凝胶30min，取5LPCR产物与6XLoading缓冲撞棍匀后点样，用DNA协rker作分子量标记，在1XTAE中以5V/cm的电压电泳30min.澳化乙键溶液(0.5g/mL)染色10min.用凝胶成像仪照相。B.4 结果判断
20、阴性对照和空白对照在256bp处未出现扩增条带，待测样品与阳性对照在256bp处出现扩增条带，判定结果为阳性。阴性对照和空白对照在256bp处未出现扩增条带，阳性对照在256bp处出现扩增条带，且样品无特异性扩增，判定结果为阴性。6 GB/T 31797-2015 附录C(规范性附录实时荧光RT-PCR撞副方法C.1 主要试剂RNA提取试剂E见B.1. 1. B. 1.5. C.2 引物和摞针序列引物HLV-F:5仁CGTGGA ACG GCT CCT TCT T-3 ;引物HLV-R:S-AGAGTT GTA TCC ACC GGG TAG TTT-3，探针HLV-P:5-CACCAG CC
21、G GAG TT-3.探针V端含有FAM报告荧光染料.3端含有不发荧光的摔灭基团并具有MGB分子。C.3 实验步曝C.3.1 RNA的提取见B.3.1.C.3.2 实时荧光RT-PCR以提取的RNA为模板进行实时荧光RT-PCR反应，即在25L反应体系中加人12.5L2X实时荧光RT-PCRMaster Mix(含终浓度4.0mmol/L的Mg2勺.1.5LMgCb (25 mmol!L) .0.875L引物HLV-F(20mol/L).O. 875L引物HLV-R(20mol/L) O. 625L探针HLV呻P(20mol/L) 0.25L实时荧光RTMix.1L RNA.RNase Fre
22、e dHaO补至25L.反应条件为:50C 30 min;95 C 15 mi川然后94C 15 s, 60 c 60 s.共40个循环。注s反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整.也可采用其他商业实时荧光RTPCR试剂盒.C.4 结果判定实时荧光PCR反应结束后，应设置无效基线范围，基线范围选择在3个.，15个循环，如果有强阳性样本，应根据实际情况调整基线范围。阔值设置原则以基钱刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点，且Ct值=40为准.在阳性对照、阴性对照和空白对照正确的前提下za) 如果待测样品的Ct值大于或等于40时，则判定结果为阴性。b) 如果待测样品的Ct值
23、小于或等于35时，则判定结果为阳性。c) 如果待测样品的Ct值小于40且大于35时，应重新进行测试，如果重新测试的Ct值大于或等于40时，则判定结果为阴性F如果重新测试的Ct值小于或等于35时，则判定结果为阳性p如果重新测试的Ct值小于40且大于35.且分离曲线明显时，则判定结果为阳性。7 GB/T 31797-2015 O. 1 主要试剂0.1.1 RNA提取试剂见B.1.1 B.1. 5. 0.1.2 10XMOPS(pH7.0) 附录D(规施性附录)班点杂交撞测方法MOPS(pH 7.0) 0.4 mol/L 乙踵铀(NaAc)0.1 mol/L 乙二腊四乙酸(EDTA)0.01 mol
24、/L 用2mol/L氢氧化铺(NaOH)调pH至7.0.加双蒸水定容至1L，用0.45m的捷膜过谑除菌，室温避光保存。0.1.3 变性液(现用现配甲醒(12.3mol/L) 甲酷胶10XMOPS 4 C贮存，无须灭菌。0.1.4 20XSSC(pH 7.0) 162L 500L 100L 氯化铀(NaCl)17.53 g 拧攘酸铀8.82 g 用1mol/L盐酸(HCl)榕液调pH至7.0，加双蒸水定容至100mL，高压灭菌待用。0.1.5 10%十二烧基磺酸铀(SDS)十二烧基磺酸铀10 g 用80mL双蒸水榕解，加热到68C并用磁力搅拌器搅拌有助于榕解。如果需要，用1mol/L盐酸溶液调p
25、H至7.2.用双蒸水定容至100mL.室温保存。无须蒸汽高压灭菌。0.1.6 马来酸缓冲液(pH7.5) 马来酸氧化铀(NaCl)加双蒸水定容至100mL，灭菌待用。0.1.7 1%封闭液(现用现配)封闭剂(-20C保存用马来酿缓冲液定容至100mL. 1.16 g 0.877 5 g 1 g 注z此处要求马来酸pH严格，否则不浴，封闭1ft很难溶，要稍加热(50c左右).并用磁力搅拌子搅拌溶化.0.1.8 抗体溶液现用现配Anti-DIG-AP(4 C保存)用封闭液定容至100mL. 0.1.9 洗涤缓冲液(现用现配马来酸缓冲液吐温-20(Tween-20) 8 10L 100 mL 0.3
26、 mL D.1.10 检测缓冲被(pH9.5) Tris碱氯化铺(NaCD加双蒸水定容至100mL，灭菌待用。D. 1. 11 CSPD稀薄液1.211 g 0.585 g 将CSPD用力摇匀后，每6滴-8滴cSPDbn入1mL检测缓冲液，混匀。D. 1. 12 通用显影捞。D. 1. 13 酸性定影粉。D.2 试验步骤D.2.1 RNA的提取见B.3.1.D.2.2 样晶处理GB/T 31797-2015 将1.5LRNA加入PCR反应管中，加入3倍体联(4.5L)的变性液，混匀，瞬离，65C放置15 min，冰播2min，瞬离，加人等体棋(6L)的20XSSC，混句，即得到变性后的RNA样
27、品。D.2.3 点膜吸取3L变性后的RNA样品点于杂交膜上，待干燥后，再重复一次。D.2.4 固定将点好的膜正面朝上放于紫外交联仪中，能量120m1/cm2放置3min或将点好的膜放人烘箱中，80 c放置lh-2h或120c放置30min。D.2.5 预杂交将固定好的膜放人杂交瓶中，并加入杂交接(12mL/I00 cm2 -15 mL/I00 cm2膜)，68c预杂交30 min-3 h，弃杂交掖.D.2.6 来支将标记的RNA探针(20ng/mL-I00 ng/mL杂交液加入1.5mL离心管中，覆盖50L-I00L杂交液，勿混合，沸水中煮6min-l0 min，冰浴2min，将其与杂交液(8
28、mL/I00 cm2 -10 mL/I00 cmz膜混匀，加人杂交瓶中，68C杂交6h以上(一般过夜)，倒出杂交液。D.2.7 洗膜用2XSSC和0.1%十二烧基磺酸铀混合液(12mL/I00 cmz -15 mL/100 cm2膜室温洗膜2次，每次5min，弃混合液.用68C预热的O.IXSSC和0.1%十二镜基磺酸铀混合液(12mL/I00 cm2-15 mL/I00 cmz膜)68C洗膜2次，每次15min，弃混合液。用洗涤缓冲破02mL/I00 cm2 -15 mL/ 100 cm2膜)室温洗膜5min，弃洗涤液。D.2.8封闭用1%的封闭液(12mL/I00 cm2 -15 mL/I
29、00 cm2膜)室温孵育30min，弃封闭液。9 GB/T 31797-2015 0.2.9 结合镜体加人抗体榕液(12mL/100 cm2 -15 mL/100 cm2膜)37C孵青30min，弃抗体溶液。0.2.10 洗选用洗涤缓冲液(12mL/100 cm2-15 mL/100 cm2膜室温洗膜2次，每次15min，弃搅涤液。0.2.11 平衡用检测缓冲液(12mL/100 cm2-15 mL/I00 cm2膜室温平衡10min. 注:D.2.5-D.2.11步骤中周到的各种液体可根据试验具体情况进行调整，但要确保膜能浸没于液体中且不漂浮。0.2.12 感光处理将杂交膜放入一边封好的杂交
30、袋中杂交膜点样面朝上)，并将相邻两边封好，在点样面上加入适量的CSPD稀释液。mL/100cm2膜)，迅速将杂交袋放平，用于反复轻推数次，使CSPD稀释液在膜上扩散均匀，严防杂交袋与膜之间有气泡，20C-30 c放置5min-10 min.此步骤操作要快，防膜干燥.将多余的CSPD液体挤干净，封口，37C温青15min.25 min. 0.2.13 压片在晴室中，膜正面向上放于晴盒，将比膜稍大的X光片平整地压于膜上，封好晴盒，必要时可用胶带固定杂交袋。暗盒内曝光约1.5h. 0.2.14 显影和定影曝光后，在暗室内取出感光后的胶片放于显影液内显影4min-5 min，打开绿光灯一尺距离观察显影
31、效果，当可以清楚地看到阳性对照或检测到的阳性显影清楚后，将胶片放入清水中冲洗30s，放入定影液中定影10min，再用流水冲挽30s，拿出暗室。注2届光和显影时间可根据试验具体情况进行调整，以达到最佳效果.0.3 结果判断阴性对照和空白对照未出现杂交斑，待测样品与阳性对照出现杂交斑，判定结果为阳性。阴性对照和空白对照未出现杂交斑，阳性对照出现杂交斑，且样品无杂交斑，判定结果为阴性。10 GB/T 31797-2015 参考文献lJ 郭立新，段维军，张祥林，等.实时荧光RT-PCR检测啤酒花潜隐类病毒口J.植物病理学报，2012 ,42 (5)1466-473. 2J Adams A N ,Bar
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