1、ICS 13. 100 C 60 , 中华人民共和国国家职业卫生标准GBZ/T 243-2013 单细胞凝胶电泳用于受照人员剂量估算技术规范Specification of dose estimation for the radiatiolll victims in the early stage using singRe ceU gel electrophoresis 2013-03-14发布2013-07-01实施d普叫飞ZVLL气中华人民共和国卫生部发布叫照/中华人民共和国国家职业卫生标准单细胞凝胶电泳用于受照人员剂量估算技术规范GBZ/T 243-2013 * 中国标准出版社出版发行北
2、京市朝阳区和平里西街甲2号。00013)北京市西城区三里河北街16号(100045)网址总编室:(010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销* 开本880X 1230 1/16 印张0.5字数8千字2013年4月第一版2013年4月第一次印刷 书号:155066. 2-24359定价14.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107前言根据中华人民共和国职业病防治法制定本标准。本标准按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。本标准由卫生部放射性疾
3、病诊断标准专业委员会提出。本标准由中华人民共和国卫生部批准。GBZ/T 243-2013 本标准起草单位z中国医学科学院放射医学研究所、中国疾病预防控制中心辐射防护与核安全医学所、山东省医学科学院放射医学研究所。本标准起草人z刘强、赵欣然、刘青杰、邓大平、姜恩海、杜利清、王彦。I / / / J /1 / - 1 范围单细胞凝胶电泳用于受照人员剂量估算技术规范GBZ/T 243-2013 本标准规定了基于单细胞凝肢电泳方法检测电离辐射导致人外周血淋巴细胞脱氧核糖核酸(DNA)损伤的剂量响应曲线和时耻响应曲线的建立方法u本标准适用于检测低传能知度(LET)射线仅如射线斗也急性外照射导致的早期(7
4、2h以内)DNA损伤。严二点半射向本标准不适用毛句受照者远期随访。2. 1 2.2 下列YF问岸义适用于本文件。/ 、,/ /、单细归自由泳咄ecell g二lect阳回is / 彗星分析Icomet aJ 在单细胞分子水平上定01 尾2.3、/;剂量响应曲或d阔叶r四ponsecurve / / 当机体受照后导愧的区应与受照剂量存在某种定量关系，可用适当的数学模式表达，可绘制出相应的刻度曲线，用其估算赚剂量、/ /二/F可I.;rr_，.;剖代可且。.仨/气/2.4 二飞二/y/时间晌应曲线time-r四pos咽机体受照后DNA损伤修复很快启动，残余的DNA损伤与受照剂量之间存在某种时相定量
5、关系，用适当的数学模式表达，以绘制出相应的刻度曲线，估算受照剂量时与剂量-响应曲线结合应用，以减少DNA损伤修复对估算结果的影响。3 单细胞凝股电豫方法3. 1 琳巴细胞分离预先在0.5mL离心管中加入0.2mL 4 .C预冷的淋巴细胞分离液.0.1mL外周血沿离心管内壁轻轻加在淋巴细胞分离液面上.3500 r/min离心2min.将分离出的灰白色淋巴细胞层转移至2mL离心管中，加PBS至2mL.轻摇混匀后1500r/min离心6min.弃上清。重复洗涤细胞2次，将细胞悬于PBS并调整细胞浓度至2X10/mL.置4C冰箱，备用。1 GBZ/T 243-2013 3.2 铺股0.75%正常熔点琼
6、脂糖凝胶直接煮沸，凝固前取100L迅速(lOs之内均匀铺于彗星玻片上，置于4C冰箱1min使凝胶固化，取制好的淋巴细胞悬液25L与75L0.75%低熔点琼脂糖凝肢混匀后均匀铺于第一层凝肢上面，置于4C冰箱固化1min D 3.3 裂解和电谏将凝肢置于新鲜配制的中性裂解液中，4c冰箱中裂解1.5h。裂解后用双蒸水漂洗去掉多余的盐分，置于提前加入4DC O. 5 % Tris-boracic-EDT A CTBE)电泳液的水平电泳仪中静置20min，然后在20 V ,200 mA电泳条件下电旅20min。3.4 染色和观察2g/mL澳化乙链CEB)染色，双蒸水漂洗，去掉多余染液，在荧光显微镜下采集
7、彗星图像，每份样品采集的细胞数可根据附录A提供的公式计算，但每份至少采集50个彗星图像，实验至少重复3次。3.5 彗星细胞的选择和彗星细胞率Cp)选择头、尾荧光清晰，元重叠，无杂质干扰的彗星细胞z彗星细胞率为彗星细胞数除以观察细胞总数，以百分数计算。3.6 DNA损伤的定量分析采用彗星分析软件定量分析DNA损伤程度，Olive尾矩定量表示DNA损伤水平。4 剂量晌应曲线的建立4.1 对供血者要求男女各选一人，年龄18岁60岁，元肿瘤病史，元慢性病史，元有毒有害物质接触史，未接受过大剂量的放射诊断、治疗史，不吸烟，不酣酒。4.2 细胞样晶照射条件包埋于凝胶中的淋巴细胞样品均匀照射，剂量范围0.1
8、Gy 5. 0 Gy，剂量点至少7个，且分布均匀，低于0.5Gy剂量点应选2个3个，冰上照射，照后立即进行细胞裂解。4.3 单细胞凝胶电ilc按照第3章的操作规程进行。4.4 剂量晌应曲线方程的拟合进行曲线拟合，若呈直线趋势，即用直线模式，见式。): 2 式中zY-Olive尾矩值zc一一自发DNA损伤sa一一一次击中导致的DNA损伤ED一一照射剂量，单位为戈CGy)。Y=c+D . C 1 ) h 若呈抛物线趋势，即用二次多项式模式，见式(2): 式中zY一一Olive尾矩值zc一一自发DNA损伤z一一一次击中导致的DNA损伤zp 二次击中导致的DNA损伤ED一一照射剂量，单位为戈(Gy)。
9、Y=c+D+D2 GBZ/T 243-2013 . ( 2 ) 根据回归方程的拟合优度R2和p值的大小选择数学模型，p值0.05视为模型有统计学意义，R2越接近1说明该模型的拟合优度越高。5 时间-晌应曲线的建立5. 1 对供血者要求同4.1。5.2 血样照射条件0.5 mL抗凝人外周血样品均匀照射，剂量2.0Gy，照射温度控制在37.C士0.5C，照后将细胞置于相同温度体外培养。5.3 培养方法观察时间O.5 h72 h，时间点至少7个。照后的全血在无菌条件下接种人pH为6.87. 2的含有适量抗生素、胎牛血清的5mL Roswell Park Memorial Institute(RPMI
10、)-1640培养体系，置37c恒温箱培养，培养至相应时间点，取出进行单细胞凝胶电泳。5.4 时间-晌应曲线方程的拟合进行曲线拟合，若呈直线趋势，即用直线模式，见式。): 式中zY一一Olive尾矩值;c 自发DNA损伤za一一一次击中导致的DNA损伤ET一一照后时间，单位为小时(h)。Y=c十aT若呈抛物线趋势，即用二次多项式模式，见式(4 ): 式中=Y-Olive尾矩值3c一-自发DNA损伤F一一一次击中导致的DNA损伤zp一一二次击中导致的DNA损伤ET-一一照后时间，单位为小时(h)。Y=c+T+T2 . ( 3 ) ( 4 ) 根据拟合优度R2和p值的大小选择数学模型，值0.05视为
11、模型有统计学意义，R2越接近1说明该模型的拟合优度越高。的-ON|的守NHN阁。附录A(资料性附录)拟合剂量晌应曲线时观察细胞数的计算GBZ/T 243-2013 在预实验中观察一定量的细胞数，初步计算照后的彗星细胞率，可以根据二项式分布95%置信限公式求出应计数的细胞数，生物学实验一般允许误差采用15%，见式(A.l)、式(A.2)、式(A.3): 彗星细胞率95%置信限为=( A.1 ) 灶1.9俨孚.( A.2 ) 1. 96严严=x15% 令则( A.3 ) ( 1-P)X170.74 n 式中z户一一彗星细胞率;n一一应观察细胞数。, 倒侵权必究nv-Fu ra-y u-0 04-nu 句，-aaT餐时一nu hJV ra-号一价书一定版权专有GBZ/T 打印日期:2013年5月7日F002A
