DB12 T 521-2014 牛结核病噬菌体检测技术规范.pdf

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资源描述

1、Mycobacteriophagetbovinet s for detectionDB12ICS 11.220 B 41 天 津 市 地 方 标 准 DB12/T 5212014 牛结核病噬菌体检测技术规范 The echnical tandard of uberculosis by 2014-04-22发布 2014-07-20实施天津市质量技术监督局 发布 DB12/T 5212014 I 前 言 本标准的编写符合GB/T1.1-2009的要求。 本标准由天津市畜牧兽医局提出。 本标准由天津市动物卫生监督所起草。 本标准主要起草人:刘子芝、赵勇、李志荣、刘纪艳、尹望中、杨建华、周永燚、王颖

2、、赵晶。 本标准于2014年4月发布。 DB12/T 5212014 1 牛结核病噬菌体检测技术规范 1 范围 本标准规定了噬菌体生物扩增技术检测牛结核病的定义、设备和仪器、培养基和试剂、检测、结果判定、注意事项。 本标准适用于牛结核病的疫病普查、监测和诊断。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 NY/T 541 动物疫病实验室检验采样方法 3 定义 3.1 噬菌体 Bacteriophage,简称phage 噬菌体是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微

3、生物的病毒的总称,因部分能引起宿主菌的裂解,故称为噬菌体。 3.2 噬菌斑 plaque 在人工培养基上,细菌在噬菌体的作用下裂解形成的圆形斑,称为噬菌斑。 4 设备和仪器 a 生物安全柜 b 离心机(4000 r/min) c 振荡器 d 水浴锅(55 ) e 恒温培养箱 f 有盖离心管(50 mL) g 无菌试管(10 mL) h 移液管(10 mL) i 三角瓶(100 mL,500 mL) j 平皿(90 mm) k 移液器及配套吸头(100 L,1000 L) 5 培养基和试剂 培养基和试剂配制方法见附录A 6 检测 6.1 样本的采集 2 按照NY/T 541 进行样本采集。 6.

4、2 样本的处理 6.2.1 牛乳 取牛乳5 mL于50 mL有盖离心管中,加10 mL的3%NaoH溶液;振荡混匀,室温孵育15 min;加灭菌完全培养基至30 mL,4000 r/min离心15 min,弃去上清液;再加灭菌完全培养基至30 mL,4000 r/min离心15 min后弃去上清液;加1 mL灭菌完全培养基重悬沉淀物,无菌条件下转移至10 mL无菌试管中。 6.2.2 口鼻分泌物 取2 mL牛口鼻分泌物(或2 mL保存液中的牛口鼻分泌物棉拭子样品)于50 mL有盖离心管中,处理方法同6.2.1。 6.3 检测 6.3.1 阴性对照:吸取1 mL灭菌完全培养基于10 mL无菌试管

5、中,为“阴性对照”。 6.3.2 阳性对照:取50 L指示细胞溶液用灭菌完全培养基稀释至1.0106 cfu/mL,取1 mL稀释后的溶液于10 mL无菌试管中,为“阳性对照”。 6.3.3 灭菌双蒸水空白对照:灭菌双蒸水处理方法同 6.2.1。 6.3.4 在阳性对照、阴性对照、空白对照及样本管中分别加入100 L噬菌体D29溶液,混匀,于37 水浴锅中孵育2 h; 6.3.5 上述反应管中分别加100 L杀病毒剂,充分混匀,置于室温10 min; 6.3.6 上述反应管中分别加8 mL完全培养基,混匀; 6.3.7 上述反应管中分别加1 mL指示细胞溶液,混匀; 6.3.8 快速将反应管中

6、所有的内容物分别倒入相应的空的90 mm的无菌平皿中;立即加8 mL冷却至55 左右的琼脂培养基于各平皿中,快速混匀,置于室温定型; 6.3.9 将平皿倒置于37培养箱中培养,18 h24 h后判读结果。 7 结果判定 当阳性对照平皿中噬菌斑数目20个,阴性对照平皿的噬菌斑数少于10个,同时无菌双蒸水空白对照均无噬菌斑时,试验成立。受检样品平皿中出现大小不等的噬菌斑且20个噬菌斑,或许多噬菌斑相互融合成透明状判定为阳性;平皿中无噬菌斑出现或噬菌斑数量20个判定为阴性。 8 注意事项 8.1 试验前需将所有试剂和样本回复至室温。 8.2 加入杀毒剂后一定要彻底摇匀,以杀死全部未进入菌体里的噬菌体

7、。 8.3 由于临床样本中可能含有病原体,因此所有操作过程应符合相关生物安全操作规程,如不得用口直接接触移液器,正确使用手套、生物安全罩衣、口罩等相应的安全防护设施。 8.4 检测结束后,实验用品和废弃物,应进行高温高压或其他生物安全处理。 DB12/T 5212014DB12/T 5212014 3 附 录 A (规范性附录) 培养基和试剂配制方法 A.1 Middlebrook7H9 基础培养基 将Middlebrook7H9基础培养基(自购)4.7 g加入900 mL蒸馏水(或去离子水)中,充分混匀,溶解,121灭菌10 min,冷却至室温后使用。置于25下贮存,有效期4周。如该溶液污染

8、(浑浊),则弃用。 A.2 完全培养基 无菌条件下,将小牛血清复合物20 mL加至无菌已冷却的180 mL7H9基础培养基中,制得完全培养基。4保存备用,有效期4周。如该溶液污染(浑浊),则弃用。 A.3 3% NaoH溶液 取NaoH 30 g,溶于1000 mL蒸馏水中,121灭菌10 min,冷却后备用。 A.4 噬菌体D29溶液 自购,用无菌完全培养基将噬菌体D29调至工作浓度为1.0108Pfu/mL,4保存备用。 A.5 指示细胞溶液 耻垢分枝杆菌(ATCC, 607, 自购),用无菌完全培养基将指示细胞配制成浓度为1.0106 cfu /mL,4保存备用。 A.6 杀病毒剂 将50 mL浓硫酸加入到800 mL蒸馏水中,冷却后再溶入40 g硫酸亚铁铵。在容量瓶中稀释到1000 mL,4保存备用。贮存过程中,该溶液可能褪色或产生沉淀,但不影响其使用。 A.7 琼脂培养基 将1.5 g琼脂培养基干粉加入100 mL7H9基础培养基中,充分混匀,加热溶解,121灭菌10 min冷却至55左右时使用。置于25条件下贮存,有效期4周。再次使用则需加热融化,重融次数不得超过3次。

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