1、ICS 65.020.30B41DB41河南省地方标 准DB 41/T 15162017犬瘟热病毒、犬细小病毒二重 TaqMan MGB实时荧光 PCR 检测方法2017-12-06发布2018-03-06实施河南省质量技术监督局发布DB41/T 15162017I前 言本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由河南省畜牧局提出。本标准起草单位：河南省动物疫病预防控制中心，驻马店市动物疫病预防控制中心，三门峡市动物疫病预防控制中心，鹤壁市畜产品质量监测检验中心，信阳市动物疫病预防控制中心,平顶山市动物疫病预防控制中心。本标准主要起草人：闫若潜、班付国、王华俊、赵雪丽、谢彩华、刘
2、梅芬、赵明军。本标准参加起草人：杨晴、孙素芳、曹伟伟、王淑娟、郭育培、王建科、黄清、韩楠、马超锋、朱前磊，杨海波、李方方。DB41/T 151620171犬瘟热病毒、犬细小病毒二重 TaqMan MGB 实时荧光 PCR 检测方法1范围本标准规定了犬瘟热病毒（CDV）、犬细小病毒（CPV）二重TaqMan MGB实时荧光PCR（FQ-PCR）检测样品采集、处理、存放及运输，操作方法及结果判定。本标准适用于对疑似CDV、CPV感染动物的唾液、鼻液、眼角分泌物、粪便、肠内容物、血清等待检样品和死亡动物的淋巴结、扁桃体、肺脏、脾脏、肾脏等组织样品的病毒核酸检测。2 试剂和仪器设备2.1 试剂2.1.
3、1 拭子悬液（见附录 A），组织悬液（见附录 A），以上试剂-20 保存。2.1.2 裂解液（TriZol），氯仿，1核酸电泳缓冲液，0.01 mol/L（pH 7.2）的磷酸盐缓冲液（PBS）（见附录 A），二乙基焦碳酸酯处理水（DEPC 处理水）（见附录 A），以上试剂 4保存。2.1.3 异丙醇，75%乙醇，-20 保存。2.1.4 消化液，TE 缓冲液（见附录 A），以上试剂常温保存；消化液（见附录 A），阳性对照、阴性对照（见附录 A），以上试剂置-20 保存。2.1.5 酚/氯仿/异戊醇混合液(25:24:1)（见附录 A），试剂 4保存。2.1.6 TaqMan FQ-PCR 检
4、测用上、下游引物及探针序列参见附录 B。2.1.7 犬瘟热病毒（CDV）、犬细小病毒（CPV） 二重 TaqMan FQ-PCR 反应混合液组成、说明及使用注意事项参见附录 C。2.2 仪器设备实时荧光定量PCR仪，高速冷冻离心机（12 000g以上），生物安全柜，恒温水浴锅，2 8 冰箱，-70 冰箱，单道微量移液器（0.1 L2.5 L，0.5 L10 L，2 L20 L，20 L200 L，100 L1 000 L），组织匀浆器或研钵，真空干燥器（非必备）。3 样品采集、处理、存放及运输3.1 样品采集及处理3.1.1 疑似感染动物样品用拭子采集疑似 CDV、CPV 感染动物唾液、鼻液、
5、眼角分泌物、粪便、肠内容物悬液等样品，放入盛有 1.0 mL 拭子悬液（见附录 A）的 Eppendorf 管中，然后将样品悬液转入无菌 Eppendorf 管中，4 条件下 5 000 r/min 离心 10 min，取上清转入新的无菌 Eppendorf 管中，编号备用。3.1.2 组织样品DB41/T 151620172组织样品采集时应采取有明显病变的淋巴结、扁桃体、肺脏、脾脏、肾脏等组织样品。用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品 0.5 g 左右于组织匀浆器或研钵中充分匀浆或研磨，再加 0.3 mL0.5 mL 组织悬液混匀，然后将组织悬液转入无菌 Eppendorf 管中，4条件下 5 0
6、00 r/min 离心 10 min，取上清转入新的无菌 Eppendorf 管中，编号备用。3.1.3 血清样品用无菌注射器自耳静脉或前腔静脉采集血液 3 mL5 mL，待血清析出后直接吸取至无菌 Eppendorf管中，编号备用。3.2 存放与运送采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，尽快运送到实验室。样品在2 8 条件下保存应不超过24 h；若超过24 h，应放置低于-20冰箱，不宜反复冻融。4 操作方法4.1 样品 RNA 的制备4.1.1 取 1.5 mL 灭菌 Eppendorf 管，每管加入 300 L 裂解液，然后分别加入待测样品、阴性对照、阳性对照各 100 L，吸头
7、反复吸打混匀（一份样品换用一个吸头）；再加入 100 L 氯仿，充分颠倒混匀（不宜过于强烈）；于 4条件下，12 000 r/min 离心 15 min。4.1.2 吸取离心后各管中的上清液 150 L 转移至新的 1.5 mL 灭菌 Eppendorf 管中（注意不要吸出中间层），加入 150 L 20 预冷的异丙醇，颠倒混匀，室温放置 15min。4.1.3 4条件下 12 000 r/min 离心 15 min（Eppendorf 管开口保持朝离心机转轴方向放置）。轻轻倒去上清，将灭菌离心管倒置于吸水纸上，吸干液体，不同无菌离心管应置于吸水纸不同地方沾干。加入 1 mL 75 %乙醇，轻
8、轻颠倒洗涤。4.1.4 4条件下 12 000 r/min 离心 5 min（Eppendorf 管开口保持朝离心机转轴方向放置）。轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同无菌离心管应在吸水纸不同地方吸干。4.1.5 4条件下 12 000 r/min 离心 30 s，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干，一份样本换用一个吸头，吸头不应触及沉淀，真空抽干 3 min5 min 或室温干燥 10 min。不宜过于干燥，以免 RNA 不易溶解。4.1.6 加入 11 L DEPC 处理水，轻轻混匀，溶解管壁上的 RNA，2 000 r/min 离心 5 s，冰上保存备用。提
9、取的 RNA 应在 2 h 内进行 RT-PCR 扩增或放置于 70 冰箱备用。4.1.7 样品 RNA 制备可采用上述提取方法也可采用商品化的试剂盒提取。4.2 样品 DNA 的提取4.2.1 取 1.5 mL 无菌离心管，于各管中分别加入待测样品、阴性对照、阳性对照各 100 L，再加入500 L 消化液和 10 L 消化液， 吸头反复吸打混匀（一份样品换用一个吸头）； 置 55 水浴 30 min1h。4.2.2 分别加入 500 L 酚/氯仿/异戊醇混合液，混匀，于 4 条件下 12000 r/min 离心 10 min。4.2.3 分别吸取离心后的上清液转移至新的 1.5 mL 无菌
10、离心管中（注意不要碰到中间层），加入等体积-20 预冷的异丙醇，混匀，室温放置 15 min。DB41/T 1516201734.2.4 4 条件下 12 000 r/min 离心 15 min（离心管开口保持朝离心机转轴方向放置）。轻轻倒去上清液，将无菌离心管倒置于吸水纸上，吸干液体，不同无菌离心管应在吸水纸不同地方吸干。加入700 L 75 %乙醇，轻轻混匀。4.2.5 4 条件下 12 000 r/min 离心 5 min（离心管开口保持朝离心机转轴方向放置）。轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干。4.2.6 4 条件下 12 000 r/min 离心
11、 30 s，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干，一份样品换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀一面，真空抽干 3 min5 min 或室温干燥 10 min。4.2.7 加入 10 L TE 缓冲液，轻轻混匀，溶解 DNA，2 000 r/min 离心 5 s，置-20 冻存备用。4.2.8 DNA 的制备可采用 4.2.14.2.7 提取方法也可采用商品化的试剂盒提取。4.3 反转录（cDNA 的合成）4.3.1 反转录反应混合液组成：M-MLV 5Reaction buffer(含 Mg2+)，4L；2.5 mM dNTPs，4 L；M-MLV（200 U/L），0.5 L；
12、RNA 酶抑制剂（4 0 U/L），0.5 L；反转录引物（Unit-P）1 L；总体积10 L 。4.3.2 向每管中加入 4.1.6 中相应 RNA 10 L，37水浴 1h 或置于 PCR 仪中 37 1h，反应结束后，70 15 min 灭活反转录酶， 直接用于下面的二重 FQ RT-PCR 扩增或20 冻存备用。4.4 二重实时荧光 PCR 扩增4.4.1 二重实时荧光 PCR 反应混合液组成：10PCR 缓冲液(含 Mg2+)，2.5 L；2.5 mM dNTPs，2 L；CDV-P1，0.5 L；CDV-P2，0.5 L；CDV-Probe 1.0 L；CPV-P1，0.5 L；
13、CPV-P2，0. 5 L；CPV-Probe1.2 L；Taq DNA 聚合酶（5 U/L），0.25 L ；水，12.25 L；总体积为 21 L。4.4.2 在检测区配制与 4.1、 4.2 中相同数量的实时荧光 PCR 反应体系 n 管，向每管中加入 4.3 和 4.2.5中相应 cDNA 和 DNA 各 2 L，充分混匀后并使液体全部聚集于管底，按照加样顺序摆放好实时荧光 PCR反应管。4.4.3 将 4.4.1 中加样后的实时荧光 PCR 反应管放入实时荧光定量 PCR 仪内并记录样本摆放顺序。4.4.4 反应参数设置：第一阶段，预变性 94 /5 min；第二阶段，94 /30
14、s，60 /30 s，40 个循环，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号收集，荧光模式设为 FAM/NONE 和 VIC/NONE 双标记模式。5 结果判定5.1 结果分析条件设定阈值设定以阴性对照扩增曲线的最高点为原则，读取检测结果。5.2 质量控制标准阴性对照的检测结果应无特定的扩增曲线，且 Ct值32.0或无；阳性对照的 Ct值应29.0，且出现特定的扩增曲线（参见附录C）。5.3 结果描述及判定5.3.1 阳性DB41/T 151620174在质量控制标准成立的前提下，样品 Ct值29.0，且出现两条特定的扩增曲线，判定为CDV、CPV病毒核酸阳性；出现一条特定的扩增曲线，判定为对应的病
15、毒核酸阳性。5.3.2 阴性在质量控制标准成立的前提下，样品 Ct值32.0或无，且无特定的扩增曲线，判定为CDV、CPV病毒核酸阴性。5.3.3 可疑在质量控制标准成立的前提下，样品29.0 Ct值32.0，且有特定的扩增曲线，样品应重新检测，结果为阳性者判定为病毒核酸阳性，否则判定为病毒核酸阴性。DB41/T 151620175AA附录A（规范性附录）试剂的配制A.1 组织悬液在0.01 mol/L PBS液中添加青霉素(2 000 I U/m L)，链霉素(2 m g/mL)、庆大霉素(50 p g/mL)和制霉菌素(1 000 I U/m L)。A.2 拭子悬液在0.01 mol/L
16、PBS液中添加组织悬液所有的抗生素， 浓度提高5倍； 加入抗生素后调pH值至7.27.4。A.3 消化液Tris-HCl（pH 8.0）终浓度 10 mmol/L；EDTA（pH 8.0）终浓度 25 mmol/L；SDS（w/v）终浓度 0.5 %；NaCl 终浓度 100 mmol/L。A.4 TE缓冲液Tris-HCl (pH 8.0)终浓度为10 mol/L，EDTA (pH 8.0) 终浓度为1 mol/L。A.5 酚/氯仿/异戊醇溶液Tris饱和酚：氯仿：异戊醇按25:24:1的比例混合。A.6 0.01 mol/L（pH 7.2）的磷酸盐缓冲液（PBS）A.6.1 A液（0.2
17、mol/L磷酸二氢钠水溶液）：NaH2PO4H2O 27.6 g，用适量蒸馏水溶解，定容至1 000mL。A.6.2 B液（0.2 mol/L磷酸氢二钠水溶液）：Na2HPO412H2O 71.6 g，用适量蒸馏水溶解，定容至1 000 mL。A.6.3 0.01 mol/L PBS的配制：A液14 mL，B液36 mL，加NaCl 8.5 g，用蒸馏水定容至1 000 mL；121 高压灭菌15 min，4保存备用。A.7 消化液称取100 mg蛋白酶K溶解于5 mL灭菌水中。A.8 二乙基焦碳酸酯处理水（DEPC处理水）DB41/T 151620176用0.1 %DEPC处理后的去离子水，
18、经121 15 min高压处理，用于溶解RNA。A.9 阳性对照经灭活的CDV、CPV细胞培养物。A.10 阴性对照正常VERO细胞和正常MDCK细胞。DB41/T 151620177BB附录B（规范性性附录）犬温热病毒、犬细小病毒二重 TaqMan MGB 实时荧光 PCR 检测方法所用引物犬温热病毒、犬细小病毒二重TaqMan MGB实时荧光PCR检测方法所用引物见表B.1。表 B.1 犬温热病毒、犬细小病毒二重 TaqMan MGB 实时荧光 PCR 检测方法所用引物引物名称 引物浓度 引物序列PCR扩增上游引物CDV-P1 20 pmol/ L 5-GGATGGTGCC TGCATTG
19、G-3PCR扩增下游引物CDV-P2 20 pmol/ L 5-CCGACTCCAG ACAATTTTTT TGT-3PCR反转录引物Unit-P 20 pmol/ L Pd（N）9-含有9个碱基的随机序列PCR扩增上游引物CPV-P1 20 pmol/L 5-ATGCCATTTA CTCCAGCAGC TAT-3PCR扩增下游引物CPV-P2 20 pmol/L 5-GGTATGGTTG GTTTCCATGG AT-3PCR扩增探针CDV-Probe 10 pmol/L 5-FAM-CTCTGAGCAA CAAGAAG-MGB-3PCR扩增探针CPV-Probe 10 pmol/L 5-VIC-AGATCTGAGA CATTGGGTTT-MGB-3DB41/T 151620178C附录C（资料性附录）犬瘟热病毒、犬细小病毒 TaqMan MGB 二重实时荧光 PCR 检测标准扩增曲线犬瘟热病毒、犬细小病毒TaqMan MGB二重实时荧光PCR检测标准扩增曲线见图C.1。注：1. CDV扩增曲线；2. CPV扩增曲线； 3,4. 阴性对照图 C.1 犬瘟热病毒、犬细小病毒 TaqMan MGB 二重实时荧光 PCR 检测标准扩增曲线_
