1、ICS 65.020 B 62 DB41 河南省地方标准 DB41/T 11032015 太行菊组织培养技术规程 2015 - 08 - 13发布 2015 - 11 - 13实施 河南省质量技术监督局 发布DB41/T 11032015 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.12009 给出的规则起草。 本标准由河南省林业标准化技术委员会提出并归口。 本标准起草单位：郑州大学、河南省绿洲园林有限公司。 本标准主要起草人：史屹峰、黄进勇、张建波、刘彬、赵志营、王景玉、李娇。 本标准参加起草人：崔青艳、韩玉霞、乔林、张献计、王俊、复鹏、田小娟、李幸红、岳彩鹏、朱世新。 DB41/T 110320
2、15 1 太行菊组织培养技术规程 1 范围 本标准规定了太行菊组织培养的术语和定义、培养基的配制、组织培养、炼苗移栽。 本标准适用于太行菊组织培养。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 太行菊 太行菊(Opisthopapus taihangensis)，菊科菊蒿亚族太行菊属多年生宿根草本植物，中国太行山区特有珍稀物种。 3 培养基的配制 3.1 培养基选择 选择MS培养基为基本培养基（MS培养基参见附录A）。 3.2 母液与激素的配制 3.2.1 大量元素母液的配制 大量元素母液按50倍配制。使用时再稀释50倍，配好的母液放置于棕色瓶保存于4冰箱中备用。 3.2.2 微量元
3、素母液的配制 微量元素母液按100倍配制。使用时再稀释100倍，配好的母液放置于棕色瓶保存于4冰箱中备用。 3.2.3 有机母液的配制 有机母液按100倍配制。使用时再稀释100倍，配好的母液放置于棕色瓶保存于4冰箱中备用。 3.2.4 铁盐母液的配制 分别溶解FeSO 47H2O和 Na23.2.5 6-苄氨基腺嘌呤配制 -EDTA，加热并不断搅拌，使完全溶解，冷却后，将2种溶液混合，再用蒸溜水加至所需容积，按100倍配制。使用时再稀释100倍，配好的母液放置于棕色瓶保存于4冰箱中备用。 称取100mg 6-苄氨基腺嘌呤（6-BA），用少量0.1mol/L HCL加热溶解，再用蒸馏水定容至1
4、00mL,DB41/T 11032015 2 浓度为1.0mg/L。 3.2.6 萘乙酸配制 称取10mg 萘乙酸（NAA），用1mL无水乙醇溶解，再用蒸馏水定容至100mL，浓度为0.1mg/L。 3.3 培养基配方 3.3.1 1/2 MS基本培养基：1/2 MS+30g/L白砂糖+10g/L琼脂条； 3.3.2 丛生芽诱导培养基：MS+0.1mg/L NAA+1.0mg/L 6-BA+30g/L白砂糖+10g/L琼脂条； 3.3.3 生根培养基：1/2 MS+0.2mg/L NAA+30g/L白砂糖+10g/L琼脂条； 3.3.4 无激素基本培养基：MS+30g/L白砂糖+10g/L琼脂
5、条。 3.4 配制 以配制10L培养基为例，按顺序进行如下操作： a) MS为基本培养基，取少量蒸馏水倒入容器内，除了大量元素母液取200mL外，其余母液均取100mL倒入容器内；1/2 MS为基本培养基时；取少量蒸馏水倒入容器内，除了大量元素母液取100mL外，其余母液均取50mL倒入容器内； b) 称取300g蔗糖倒入容器，搅拌溶解； c) 加蒸馏水定容至10L； d) 按照培养基配方，加入NAA和6-BA。丛生芽诱导培养基加10mL NAA和100mL 6-BA；生根培养基加20mL NAA； e) 称取100g琼脂条，倒入上面配好的溶液中，放在电炉上加热至沸腾，直到琼脂条熔化； f)
6、稍微冷却后，用精密试纸或酸度计调整pH至5.75.8，分装； g) 对分装好的培养基用高温高压蒸汽消毒，压力1.1kg/cm24 组织培养 、温度121条件下保持25min，待灭菌完成好，压力为0的时候取出培养基，平放在地面上冷却凝固。 4.1 培养材料及消毒 4.1.1 培养材料的选择和确定 10月底至11月初，采集当年饱满太行菊的种子作为培养材料，存放于4冰箱。 4.1.2 消毒灭菌 将种子用自来水冲洗2h后，在超净工作台内用75%酒精漂洗15s，后用2%的次氯酸钠浸泡8min（加2滴聚山梨酯），蒸馏水冲洗23次。 4.2 无菌播种 用无菌滤纸把种子表面附着的水分吸干净，然后在在超净工作台
7、内用镊子将种子接种到1/2MS培养基上，置入温度为2025光照培养室内诱导种子萌发，待种子发芽长出2片真叶，进行光照处理，光照强度2500lx，光照时间14h/d，培养30d35d。 4.3 诱导及分化 DB41/T 11032015 3 切除长出来的无菌幼苗根部部分，把得到的无菌苗茎接种到丛生芽诱导培养基上，放到光照培养室培养30d。 4.4 增殖继代培养 将诱导出来的丛生芽分割成含23个小芽的芽丛，切去死叶和基部黄褐色疏松组织，继续接种到丛生芽诱导培养基上，放置于光照培养室进行增殖继代培养，30d为一个周期，如此循环。 4.5 培养环境 温度为251，光照时间14h/d，光照强度2500l
8、x,相对湿度70%80%。 4.6 生根培养 4.6.1 生根苗的选择 从组培苗中切取生长健壮、叶色正常、叶片舒展的无根苗。 4.6.2 诱导生根 在超净工作台内，将无根苗上长至4cm以上的再生芽从基部切下，接种到生根培养基上，诱导根原基的形成，黑暗培养3d5d。后将其接种到无激素MS培养基诱导根的伸长，光照培养20d25d。 5 炼苗移栽 5.1 炼苗 待根长至3cm时开始炼苗，将培养瓶放置温室自然散射光下，温度控制在251，闭口炼苗2d3d，再打开瓶盖，加入3mL800倍多菌灵溶液，炼苗3d5d。 5.2 移栽 用镊子将生根苗从培养瓶中取出，洗去基部培养基，在800倍多菌灵溶液中浸泡30m
9、in后移栽到基质中。基质采用草炭土、蛭石、珍珠岩比例为3:1:1。温度251，前3d4d相对湿度保持在80%90%，后逐渐降低湿度，每天叶面喷水23次，当试管苗根系发达、形成侧须根后，可移栽到花盆中。 DB41/T 11032015 4 A 附 录 A （资料性附录） MS培养基成分表 MS培养基成分见表A.1。 表A.1 单位为毫克每升 成分 含量 大量元素 硝酸钾（KNO 3 1900 ) 硝酸铵（NH 4NO3 1650 ) 磷酸二氢钾（KH 2PO4 170 ) 硫酸镁（MgSO 47H2 370 O) 氯化钙（CaCl 22H2 440 O) 微量元素 碘化钾（KI) 0.83 硼酸（H 3BO3 6.2 ) 硫酸锰（MnSO 44H2 22.3 O) 硫酸锌（ZnSO 47H2 8.6 O) 钼酸钠（Na 2MoO42H2 0.25 O) 硫酸铜（CuSO 45H2 0.025 O) 氯化钴（CoCl 26H2 0.025 O) 铁盐 乙二胺四乙酸二钠（Na 2 37.25 -EDTA) 硫酸亚铁（FeSO 47H2 27.85 O) 有机 肌醇 100 甘氨酸 2 盐酸硫胺素（VB 1 0.1 ) 盐酸吡哆醇（VB 6 0.5 ) 烟酸（VB 5 0.5 ) B _
