1、湖南省地方标准DB43辣椒花药培养技术规程Technical rules of anther culture for pepperDB43/T 9852015 ICS 65.020.20B 05湖南省质量技术监督局 发 布2015-03-23 实施2015-01-23 发布DB43/T 9852015 I 目 次 前言 1 范围 12 规范性引用文件 13 术语与定义 13.1 花药培养 13.2 单核靠边期 13.3 胚状体 13.4 单倍体 14 试剂 15 仪器和设备 26 培养基配制与灭菌 27 炼苗基质配制与灭菌 28 花药培养技术流程 28.1 花蕾采集 28.2 花蕾处理 28.
2、3 花蕾消毒 38.4 花药接种 38.5 花药培养 38.6 胚状体分化成苗 38.7 组培苗炼苗与移栽 38.8 组培苗倍性鉴定 3附录 A（规范性附录） 辣椒花药培养档案记载表 4DB43/T 9852015 II 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。 本标准的某些内容可能涉及专利，本标准的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由湖南省蔬菜研究所提出。 本标准由湖南省农业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：湖南省蔬菜研究所。 本标准主要起草人：杨博智、周书栋、王利群、欧立军、邹学校、戴雄泽、马艳青、李雪峰、张竹青、陈文超，梁成亮。 DB43/T 985201
3、5 1 辣椒花药培养技术规程 1 范围 本标准规定了辣椒花药培养技术流程。 本标准适用于辣椒花药培养。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682-2008 中国国家实验室分析用超纯水标准 3 术语与定义 下列术语与定义适用于本标准。 3.1 花药培养 指采用植物组织培养技术，把发育到一定阶段的花药，通过无菌操作技术接种在人工培养基上，以改变花药内花粉粒的发育程序诱导其分化，并连续进行有丝分裂形成细胞团，进而形成一团无分化的薄壁组织-愈伤组
4、织，或分化成胚状体，形成完整的植株的一种培养方式。 3.2 单核靠边期 指四分体的胼胝质壁完全溶解后，中央大液泡开始形成，将细胞核从中心挤压到靠近细胞壁时所处的时期，此时花蕾形态特征为花瓣微露出花萼或与花萼齐平。 3.3 胚状体 指辣椒花粉粒（小孢子）经过雄核发育成为多细胞花粉后，细胞数目进一步增加，花粉外壁膨大，冲破花粉壁，形成的多细胞团。胚状体按生长阶段分为原胚、心形胚、鱼雷形胚和成熟胚。 3.4 单倍体 体细胞中含有本物种配子的染色体数目的个体。 4 试剂 4.1 超纯水 应符合GB/T 6682中规定的三级超纯水。 4.2 试剂 DB43/T 9852015 2消毒试剂：酒精、次氯酸钠
5、； 无机试剂：硝酸铵、硝酸钾、氯化钙、七水硫酸镁、磷酸二氢钾、碘化钾、硼酸、四水硫酸锰、七水硫酸锌、三氧化钼、钼酸钠、硫酸铜、氯化钴、硫酸亚铁、EDTA二钠盐； 有机试剂：肌醇、烟酸、盐酸吡哆醇、盐酸硫胺素、甘氨酸、叶酸、生物素、核糖核酸酵母、谷氨酰胺、丝氨酸、脯氨酸； 生长调节剂：a-萘乙酸、激动素； 其它试剂：硝酸银、秋水仙碱、琼脂粉、活性炭和蔗糖。 所有试剂等级均为分析纯。 5 仪器设备 超纯水仪、电子分析天平（精确度：0.0001 g）、pH计（或pH试纸）、刻度容量瓶、移液管、恒温培养箱（温度范围：565）、电磁炉、超净工作台、高压灭菌锅、电热恒温干燥箱（温度范围：5300)。 6
6、培养基配制与灭菌 花药培养基成分为：每升培养基中含有 720 mg 硝酸铵、950 mg硝酸钾、166 mg氯化钙、185 mg七水硫酸镁、68 mg磷酸二氢钾、10 mg硼酸、25 mg四水硫酸锰、10 mg七水硫酸锌、0.25 mg三氧化钼、0.025 mg硫酸铜、0.025 mg氯化钴、27.8 mg硫酸亚铁、37.8 mg EDTA二钠盐、100 mg 肌醇、5 mg烟酸、0.5 mg盐酸吡哆醇、0.5 mg 盐酸硫胺素、2 mg甘氨酸、0.5 mg叶酸、0.05 mg生物素、0.5 mg核糖核酸酵母、0.8 g谷氨酰胺、0.3 g丝氨酸、0.1 mg脯氨酸、0.25 mg a-萘乙酸
7、、1.00 mg激动素、0.5 g硝酸银、0.03 g秋水仙碱、6 g琼脂粉、2.5 g活性炭、30 g蔗糖。 胚状体分化成苗培养基成分为：每升培养基中含有1650 mg 硝酸铵、1900 mg 硝酸钾、440 mg氯化钙、370 mg七水硫酸镁、170 mg磷酸二氢钾、0.83 mg碘化钾、6.2 mg硼酸、22.3 mg四水硫酸锰、8.6 mg七水硫酸锌、0.25 mg钼酸钠、0.025 mg硫酸铜、0.025 mg氯化钴、27.8 mg硫酸亚铁、37.8 mg EDTA二钠盐、100 mg肌醇、0.5 mg烟酸、0.5 mg盐酸吡哆醇、0.1 mg盐酸硫胺素、2.0 mg甘氨酸、6 g琼
8、脂粉、30 g蔗糖。 培养基配制后调pH值为5.86.0，然后置于高压灭菌锅中120，1.06 kg/cm2条件下灭菌15 min。 7 炼苗基质配制与灭菌 蛭石和珍珠岩按1:1比例混合后分装成0.5 kg/袋，置于电热恒温干燥箱中180消毒1 h。 8 花药培养技术流程 8.1 花蕾采集 选择生长势好、无病虫害的健壮植株，取始花期后30 d之内处于单核靠边期的花蕾，装入底部铺有湿润棉花的培养皿中，将培养皿置于冰箱中4C预处理48 h。 8.2 花蕾处理 用尖头镊子在花蕾表面中部处划圈，剥去花蕾上半部分处的花萼，露出花瓣，冲洗干净。 DB43/T 9852015 3 8.3 花蕾消毒 超净工作
9、台上将处理后的花蕾装入尼龙网袋中，浸入70%酒精中消毒30 s 后，无菌蒸馏水冲洗1-2次，再用5%次氯酸钠溶液消毒12 min后，无菌蒸馏水冲洗23次，将花蕾放入已消毒的垫有双层滤纸的培养皿中，吸干花蕾表面水分，用于接种。 8.4 花药接种 用尖头镊子挑开花瓣，取出花药，去除花丝，接种于花药培养基表面，盖好盖子，用封口膜封口，标注实验材料名称和接种日期。 8.5 花药培养 将培养皿放入恒温培养箱中35C下黑暗培养8 d，再于 25C下继续黑暗培养至胚状体产生，培养过程中注意观察花药染菌情况，如发现有染菌的花药出现，立即取出该培养皿，以免污染其它培养皿。 8.6 胚状体分化成苗 当花药分化出胚
10、状体时，剥取胚状体，接种于胚状体分化成苗培养基中培养至成苗。将培养瓶放入光照培养室中，培养条件为白天（2426）C，晚上（2224）C，光照时间（1415）h，光照强度1500 lx。 8.7 组培苗炼苗与移栽 将4-7叶的组培苗取出，自来水下冲洗掉培养基，栽种于装有炼苗基质的盆中，浇水后用塑料袋覆盖保湿，置于与光照培养室条件一致的炼苗室中。7 d 后取掉塑料袋，将炼苗室环境逐步调整到与辣椒苗在外界生长的环境相近，15 d后移栽幼苗。 8.8 组培苗倍性鉴定 取幼苗幼嫩根尖，采用根尖压片法进行压片，在显微镜下观察染色体数目。当组培苗染色体数目为12条时，证明该植株为单倍体。 辣椒花药培养档案记载表见附录A。DB43/T 9852015 4附录A （规范性附录） 辣椒花药培养档案记载表 序号 品种 名称 培养基 配制 时间 花蕾 采集 时间 花药 接种 时间 花药 接种 数目 花药 染菌 数目 诱导 胚状体 数目 组培苗 数目 单倍体植株 数目 记载人 1 2
