1、ICS 65.020.01 B 05 备案号： DB42 湖北省 地方标准 DB 42/ T 1290 2017 水稻花药培养技术规程 Technical regulations for anther culture of rice (报批稿 ) 2017 - 10 - 20发布 2017 - 11 - 20实施 湖北省 质量技术监督局 发布 DB42/T 1290 2017 I 目 次 前言 . III 引言 . V 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语和定义 . 1 3.1 水稻花药培养 rice anther culture . 1 4 水稻花药培养操作程序 . 1 4
2、.1 操作流程 . 1 4.2 培养基的配制 . 2 4.2.1 配制程序 . 2 4.2.2 母液的配制和保存 . 2 4.2.3 培养基的类型 . 2 4.2.4 配制方法 . 2 4.3 水稻幼穗的准备 . 3 4.3.1 取样 . 3 4.3.2 预处理 . 3 4.3.3 消毒 . 3 4.4 取花药接种 . 3 4.5 诱导愈伤组织 . 3 4.6 愈伤组织分化 . 3 4.6.1 愈伤组织转移 . 3 4.6.2 分化培养 . 4 4.7 生根 . 4 4.7.1 转移花培苗 . 4 4.7.2 生根培养 . 4 4.8 花培苗炼苗与移栽 . 4 4.8.1 炼苗 . 4 4.8
3、.2 移栽与管理 . 4 附录 A（规范性附录） 培养基母液配制成分表 . 5 附录 B（资料性附录） 常用植物生长物质及配制方法 . 6 附录 C（规范性附录） 水稻花药培养培养基配方 . 7 DB42/T 1290 2017 II DB42/T 1290 2017 III 前 言 本标准根据 GB/T 1.1 2009标准化工作导则 第 1部分：标准的结构和编写给出的规则起草。 免责申明： 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准 由 湖北省农业科学院 提出 。 本标准 由 湖北省农业科学院 归口管理。 本 标准 起草 单位：湖北省农业科学院
4、粮食作物 研究所 、 湖北省农业科学院经济作物研究所、长江大 学 。 本标准主要起草人： 游艾青、李三和、陈志军、杨国才、周 雷、刘 凯、向发云、闸雯俊、徐华山、 李培德、田小海。 DB42/T 1290 2017 IV DB42/T 1290 2017 V 引 言 水稻花药培养是现今比较广泛应用于水稻育种中的一项新的生物技术，通过花药培养可以快速纯合 育种材料、提高选择效率、有效缩短育种周期、能打破不利性状的连锁关系，扩大变异范围、准确筛选 突变体、丰富遗传研究材料、加速有效性状转移。主要应用于常规水稻育种、杂交稻亲本的提纯和选育、 水稻种质创新、永久性作图 群体的构建以及转基因育种等方面。
5、 在实际操作过程中，多种因素的影响，特别是人员操作的差异可能会导致完全不同的效果。为保证 水稻花药培养操作的规范性，更有效地服务于水稻育种和水稻其他方面的科学研究，特制定本标准。 DB42/T 1290 2017 1 水稻花药培养技术规程 1 范围 本标准规定了 水稻花药培养 技术 的 操作程序要求 。 本标准适用于 水稻的花药培养。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 DB32/T 1848-2011 水稻转基因实验室安全操作规程 DB22/T 28
6、1-2001 真菌实验室的消毒灭菌方法 DB33/T 752-2009 植物种苗组培快繁技术规程 3 术语和定义 下列术语和定义适应于本标准。 3.1 水稻花药培养 rice anther culture 水稻花药培养是用组织培养技术，把发育到一定阶段的水稻花药， 采用 无菌操作技术，接种在人工 培养基上， 通过 改变花药内花粉粒的发育程序诱导其 脱 分化，并连续进行有丝分裂形成细胞团，进而形 成一团无分化的薄壁组织 愈伤组织，随后使愈伤组织 再 分化成胚状体 或分化成 完 整的水稻植株。 4 水稻 花药培养操作 程序 4.1 操作流程 水稻花药培养操作流程见图 1。 图 1 水稻花药培养操作
7、流程 幼穗 取样 低温 预处理 消毒 炼苗 生根 培养 花培苗 移栽 分化培养 诱导 培养 取药接种 培养基配制 DB42/T 1290 2017 2 4.2 培养基的配制 4.2.1 配制程序 准备好母液、蒸馏水、蔗糖、固化剂等，按图 2的程序配制。 图 2 培养基配制程序 4.2.2 母液的配制和保存 按大量元素、微量元素、铁盐、植物生长物质分别配制母液见附录 A、附录 B。母液配制好后，放 置于 4的冰箱中保存。 4.2.3 培养基的类型 根据不同的培养阶段配制不同类型的培养基，见附录 C。 4.2.4 配制方法 诱导培养基的配制（以配制 1L培养基为例）：称取植物凝胶 3g放置锅中，加
8、入 800 mL蒸馏水，煮 至凝胶完全融化且没有泡沫；煮胶的同时，量取 N6大量元素 I、 II各 50 mL， N6微量元素 III、 铁盐 IV、 N6有机物 V各 10 mL于烧杯中，然后加入 1 mgL -1 KT 1mL、 1 mgL -1 NAA 3mL、 1 mgL -1 2, 4-D 2mL混 匀，并在母液混合液中加入 600 mg脯氨酸使其溶解；凝胶完全融化后加入 50 g蔗糖溶解，再将母液混合 液与凝胶混合，并加蒸馏水定容至 1L。混合时一定要边混合边搅动，以防培养基局部凝固。混合均匀 后用精密 pH试纸调节培养基 pH值至 5.8。趁热将培养基分装到 100 mL三角瓶中
9、，每瓶装 30 mL35 mL， 封口后高压蒸汽灭菌，冷却备用。 分化培养基的配制（以配制 1L培养基为例）：称取植物凝胶 3 g放置锅中，加入 800 mL蒸馏水，煮 至凝胶完全融化且没有泡沫；煮胶的同时，量取 MS大量元素 I、 II各 50mL， MS微量元 素 III、 铁盐 IV、 MS有机物 V各 10 mL于烧杯中，然后加入 1 mgL -1 6-BA 0.5mL、 1 mgL -1 KT 2mL、 1 mgL -1 NAA 0.5 mL 混匀；凝胶完全融化后加入 30 g蔗糖溶解，再将母液混合液与凝胶混合，并加蒸馏水定容至 1L。混合时 一定要边混合边搅动，以防培养基局部凝固。
10、混合均匀后用精密 pH试纸调节培养基 pH值至 5.8。趁热将 培养基分装到 100 mL三角瓶中，每瓶装 30 mL35 mL，封口后高压蒸汽灭菌，冷却备用。 分装 蒸馏水 +母液 +糖 pH 调整 固化剂 加热 溶解 干燥 洗涤 培养器皿 凝固 灭菌 封口 DB42/T 1290 2017 3 生根培养基的配制（以配制 1L培养基为例）：称取植物凝胶 3 g放置锅中，加入 800 mL蒸馏水，煮 至凝胶完全融化且没有泡沫；煮胶的同时，量取 MS大量元素 I、 II各 25mL， MS微量元素 III、 铁盐 IV各 5mL、 MS有机物 V 10mL于烧杯中，然后加入 1 mgL -1 I
11、BA 0.2mL混匀；凝 胶完全融化后加入 30g蔗糖， 再将母液混合液与凝胶混合，并加蒸馏水定容至 1L。混合时一定要边混合边搅动，以防培养基局部凝 固。混合均匀后用精密 pH试纸调节培养基 pH值至 5.8。在培养基中加入 0.5g活性炭粉末搅匀，趁热将培 养基分装到 100 mL三角瓶中，每瓶装 30 mL35 mL，封口后高压蒸汽灭菌，冷却备用。 植物生长物质配制方法见附录 B。 4.3 水稻幼穗的准备 4.3.1 取样 观察 外部特征和 碘 -碘化钾染色法 镜检核对，于晴天下午选取花药发育处于 幼穗分化第七期的中后 期，即 单核中晚期 （单核靠边期）的 幼穗 （ 剑叶与下一叶的叶枕距
12、约 5 cm10 cm， 颖壳 大部分 已接近成 熟的大小，呈现淡绿色，雄蕊伸长达颖壳的 1/31/2） 。 4.3.2 预处理 用 75酒精对带苞叶稻穗表面 擦拭 消毒 ，然后 将稻穗用湿润纱布包裹， 装入保鲜袋后贴上标签，注 明材料名称和取样时间等信息， 置于冰箱中进行低温预处理。 一般处理为 8， 8天 12天为宜。 4.3.3 消毒 将预处理后的稻穗 剥除苞叶， 剪取中部稻穗， 用 0.1%升汞溶液浸泡 10 min或用新配制的 3 %次氯酸 钠溶液浸泡 25 min，之后用无菌水冲洗 4次 5次，用无菌滤纸吸干水分 。 4.4 取花药接种 在无菌 操作台上，将 颖 壳 基部 1/5处
13、剪断 ，用镊子夹住颖壳，剪口朝下，在三角瓶口敲动， 将花药 抖落 至诱导培养基上，每个 100 ml三角瓶接种 80个 100个花药。 接种花药时不要剪断或碰伤花药。 4.5 诱导愈伤组织 将接种好的材料放至培养箱中暗培养（培养温度为籼稻 30，粳稻 28）至愈伤组织直径 2 mm3 mm。 4.6 愈伤组织分化 4.6.1 愈伤组织转移 DB42/T 1290 2017 4 在无菌 操作台上挑取质地坚硬、淡黄色颗粒状的愈伤组织，转移至分化培养基上。每个 100 ml三角 瓶中接 4个 5个愈伤组织。 4.6.2 分化培养 材料放至培养箱中，培养条件为光照强度 24molm-2s-136mol
14、m-2s-1，光照时长 12 hd-116hd-1， 温度 28，培养至长出 3cm5 cm的花培苗。 4.7 生根 4.7.1 转移花培苗 取生长健壮、叶色正常、完整的花培苗移植到生根培养基上，每个 100 ml三角瓶中放置 4个 5个花 培苗。 4.7.2 生根培养 将移植的花培苗放至培养箱中，直至小苗生出完整根系，苗粗壮，高度 10cm以上。培养条件为光 照强度 24molm-2s-136 molm-2s-1，光照时长 12 hd-116hd-1，温度 28。 4.8 花培苗炼苗与移栽 4.8.1 炼苗 将培养瓶放置日光温室，温度控制在 25 3 ，打开瓶盖，加水至培养基上 1cm，炼苗
15、 3d，然后 将根部培养基清洗干净，用静置过 1 d2 d的自来水继续养苗 3 d5 d，直至长出 1 cm左右的新根。 4.8.2 移栽与管理 将长出新根的花培苗移栽至田面平整、泥融的秧田。干湿交替湿润水分管理，注意防止低温死苗和 高温烧苗。 DB42/T 1290 2017 5 A A 附 录 A （规范性附录） 培养基母液配制成分表 表 A.1给出了培养基母液配制成分表的内容 。 表 A.1 培养基母液配制成分表 培养基成分 MS N6 大量元素 I（ 20） (NH4)2SO4 0 9260 NH4NO3 33000 0 KNO3 38000 56600 MgSO47H2O 7400
16、3700 KH2PO4 3400 8000 大量元素 II（ 20） CaCl22H2O 8800 3320 微量元素 III（ 100） MnSO44H2O 2230 446 ZnSO47H2O 860 150 H3BO3 620 160 KI 83 83 Na2MoO42H2O 25 0 CuSO45H2O 2.5 0 CoCl26H2O 2.5 0 铁盐 IV（ 100） Na2-EDTA 3730 3730 FeSO47H2O 2780 2780 有机物 V（ 100） VB1 40 100 烟酸 50 50 VB6 50 50 肌醇 10000 0 甘氨酸 200 200 注：单位：
17、 mg L-1 DB42/T 1290 2017 6 B B 附 录 B （资料性附录） 常用植物生长物质 表 B.1给出了常用植 物生长物质的 配制方法 。 表 B.1 常用植物生长物质 类 别 种类 1 mgL -1母液配制方法 细胞分裂素 6-BA 称取固体 100mg，将固体用 5mL 无水乙醇预溶，然后慢慢加入蒸馏水，边加边摇匀， 最后定容至 100mL，即为 1 mgL -1母液 。 KT 称取固体 100mg，将固体用 5mL 1molL -1 KOH 溶液预溶，然后慢慢加入蒸馏水，边 加边摇匀，最后定容至 100mL，即为 1 mgL -1母液 。 生长素 IBA 称取固体 1
18、00mg，将固体用 5mL 无水乙醇预溶，然后慢慢加入蒸馏水，边加 边摇匀， 最后定容至 100mL，即为 1 mgL -1母液 。 NAA 称取固体 100mg，将固体用 5mL 1molL -1 KOH 溶液预溶，然后慢慢加入蒸馏水，边 加边摇匀，最后定容至 100mL，即为 1 mgL -1母液 。 2,4-D 称取固体 100mg，将固体用 5mL 无水乙醇预溶，然后慢慢加入蒸馏水，边加边摇匀， 最后定容至 100mL，即为 1 mgL -1母液 。 DB42/T 1290 2017 7 C 附 录 C （规范性附录） 水稻花药培养培养基配方。 表 C.1给出了水稻花药培养基配方每升培
19、养基用量内容。 表 C.1 水稻花药培养培养 基配方 诱导培养基 分化培养基 生根培养基 MS 大量元素 I 0 50mL 25mL MS 大量元素 II 0 50mL 25mL MS 微量元素 III 0 10mL 5mL MS 有机物 V 0 10mL 10mL 铁盐 IV 10mL 10mL 5mL N6 大量元素 I 50mL 0 0 N6 大量 元素 II 50mL 0 0 N6 微量元素 III 10mL 0 0 N6 有机物 V 10mL 0 0 激素 6-BA 0 0.5 mL 0 KT 1mL 2 mL 0 IBA 0 0 0.2 mL NAA 3 mL 0.5 mL 0 2,4-D 2mL 0 0 介质 植物凝胶 3g 3g 3g 碳源 蔗糖 50g 30g 30g 脯氨酸 600mg 0 0 活性炭 0 0 0.5g pH 值 5.8 5.8 5.8 适用培养阶段 诱导 分化 生根 DB42/T 1290 2017 8 D
