1、 湖南省食品安全地方标准 DBS 43/0052013 水产品中氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星 和恩诺沙星残留量测定 高效液相色谱法2013-10-01 发布 2013-12-01 实施 湖南省卫生厅 发布DBS 43/ 0052013 I 前言 本标准首次发布。DBS 43/ 0052013 1 水产品中氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星残留量测定 高效液相色谱法 1 范围 本标准规定了新鲜及冷冻水产品中氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星残留量的高效液相色 谱测定方法。 本标准适用于新鲜及冷冻水产品可食部分氧氟沙星、 诺氟沙星、 环丙沙星和恩诺沙星残留量的测定。 2 规范性引用文件 下
2、列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 3 方法提要 采用酸性水溶液提取试样中待测物，经固相萃取柱净化，用带荧光检测器的高效液相色谱仪测定， 外标法定量。 4 试剂和材料 除另有说明外，所用试剂均为分析纯，实验用水为符合 GB/T 6682 规定的一级水。 4.1 乙腈:色谱纯。 4.2 甲醇:色谱纯。 4.3 磷酸：优级纯。 4.5 四丁基溴化铵。 4.6 7 mmol/L四丁基溴化铵（pH 3.0，pH 2.0，pH 1.0）：称取2.26 g四丁基溴化铵，溶解于1 L
3、水中。 用适量磷酸调pH至所需的值。 4.7 5%甲醇水溶液：取5.0mL甲醇加水稀释到100 mL。 4.8 流动相：乙腈+四丁基溴化铵溶液（7 mmol/L, pH 3.0）= 6+94 (V+V)。 4.9 标准物质：氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星，纯度均高于 98.0%。 4.10 标准储备液：分别称取 10.0mg（精确到 0.01 mg）氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星标 准物质，用乙腈溶解，定容至 100 mL，配制成浓度为 100 mg/L 的标准储备溶液。4冰箱中冷藏避光 保存，保存期不超过 3个月。 4.11 混合标准中间液：准确移取适量各标准储备液，用乙腈稀
4、释，配制成浓度为 1 mg/L 的混合标准 中间液。4冰箱中冷藏避光保存，保存期不超过一周。 4.12 标准工作溶液： 准确移取适量的混合标准中间液， 用流动相稀释,配制成 2 g/L、 5 g/L、 25 g/L、 50 g/L、500 g/L 系列标准工作溶液。临用前配制。 4.13 微孔滤膜：0.22 m，有机相型。 4.14 Oasis HLB 小柱：60 mg/3 mL，或者性能相当者。 注：Oasis HLB是由Waters公司提供的产品商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不涉 及商业目的。鼓励标准使用者尝试不同厂家或型号的固相萃取小柱。 5 仪器和设备 DBS43/
5、0052013 2 5.1 高效液相色谱仪，带荧光检测器。 5.2 分析天平：感量 0.01 mg 和 0.01 g。 5.3 旋涡混匀器。 5.4 离心机: 5 000 r/min。 5.6 水浴超声器。 5.7 氮吹仪。 5.8 离心管：50 mL。 5.9 玻璃试管：5 mL。 5.10 pH计。 5.11 固相萃取装置。 6 分析测定 6.1 样品制备 冷冻样品在进行制备前，需拿出在常温下回温散冻。然后按照以下处理方法进行样品制备。所有样 品只取可食部分。 鱼：去鳞、去皮，沿脊背取肌肉；虾、蟹类：去头、去壳、去肠线，取肌肉部分。样品切成不大于 0.5 cm 0.5 cm0.5 cm的小
6、块后,置于研磨机中研磨均匀。在制样的操作过程中，应防止样品受到污 染或发生残留物含量的变化。制备好的样品置于-18保存。 6.2 提取 准确称取样品(50.05)g,置于50 mL离心管中, 加入8.0 mL四丁基溴化铵溶液(7 mmol/L, pH 2.0)， 涡旋混合1 min后，超声提取20 min，再以5 000 r/min离心10 min。收集全部上清液于另一只干净的离 心管中。将残渣重复上述步骤提取一次。合并上清液，用四丁基溴化铵溶液(7 mmol/L, pH 2.0)定容至 20.0mL，以5 000 r/min离心10 min，上清液待用。 6.3 净化 固相萃取柱依次用3 m
7、L甲醇、3 mL四丁基溴化铵溶液（7 mmol/L, pH 1.0）活化后，准确移取上述 上清液2.0 mL上样。再依次用3mL四丁基溴化铵溶液（7 mmol/L, pH 1.0）、2 mL5%甲醇水淋洗，抽干。 最后用3mL甲醇洗脱，收集洗脱液于小玻璃试管中，45下氮气吹干。用1.0 mL流动相溶解残留物，涡 旋混匀后,经微孔滤膜过滤后作为试样溶液，供高效液相色谱分析。 6.4 高效液相色谱测定 6.4.1 参考色谱条件 色谱柱：Atlantic T3柱 (1504.6 mm，粒径 5m)，或其它等效柱。 流动相：乙腈+四丁基溴化铵溶液（7 mmol/L, pH 3.0）= 6+94（v+v
8、） 。 流速：1 mL/min。 进样量：20 L。 柱温：40。 检测波长：氧氟沙星 ex=283 nm, em= 490 nm, 其余：ex=280 nm, em= 450 nm。 6.4.2 测定 取适量样品溶液和标准工作溶液或空白样品添加标准工作溶液， 按 6.4.1 列出的条件进行液相色谱 分析测定。以标准工作溶液或空白样品添加标准工作溶液作单点或者多点校准，并用色谱图峰面积积分 值定量，外标法测定。样品溶液和标准工作溶液中各化合物的响应值应在仪器检测的线性范围内。在上 述色谱条件下，标准工作溶液中各化合物的液相色谱图参见附录 A 中图A.1 标准溶液液相色谱图，空白 样品添加标准物
9、的液相色谱图参见附录 A 中图A.2 样品中添加标准物质液相色谱图。 DBS 43/ 0052013 3 6.4.3 空白试验 除不加样品外，均按照测定步骤进行平行实验。 7 结果计算和表述 样品中氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星或恩诺沙星的含量由色谱数据处理软件或按下式计算获得： m 2 3 1 s S A V A V V C X X样品中氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星或恩诺沙星的含量（g/kg）； A样品中相应药物的峰面积； As标准工作溶液中相应药物的峰面积； Cs标准工作溶液中相应药物的浓度（ng/mL）； V1提取样品所用提取液的总体积（mL）； V2固相萃取净化上样的体积（mL）； V3
10、过柱后定容所用流动相体积（mL）； m供试样品的质量（g）。 测定结果用两次平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。 8 方法线性范围、灵敏度、准确度和精密度 8.1 线性范围 各化合物混合标准工作溶液的线性范围为 2 g/L500 g/L。 8.2 灵敏度 本方法各化合物的定量下限均为 4 g/kg。 8.3 准确度 本方法在 4 g/kg、10 g/kg、100 g/kg、1000 g/kg 四个添加浓度的回收率如下：氧氟沙星 73.4%106.6%；诺氟沙星71.6%99.0%；环丙沙星 68.5%92.8%；恩诺沙星 70.9%97.3%。 8.4 重复性 本方法的相对标准偏差15
11、%。 DBS43/ 0052013 4 附录A (资料性附录) 高效液相色谱图 OFL - 5.394 NOR - 6.654 CIP - 7.560 ENR - 11.021 EU 0.00 20.00 40.00 60.00 80.00 100.00 120.00 140.00 分钟 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00图 A.1 标准溶液液相色谱图 OFL - 5.451 NOR - 6.509 CIP - 7.418 ENR - 10.640 EU 0.00 20.00 40.00 60.00 80.00 100.00 分钟 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00图 A.2 空白样品中添加标准物质液相色谱图 注: 以上图谱中，OFL 为氧氟沙星、NOR 为诺氟沙星、CIP 为环丙沙星、ENR为恩诺沙星。
