1、湖南省地方标准DB43辣椒体细胞胚诱导技术规程DB43/T 12382016 ICS 65.020.20B 05湖南省质量技术监督局 发 布Technical regulations of Induction of Somatic embryo in pepper2017-03-01实施2016-12-30发布DB43/T 12382016 I 目 次 前言1 范围 12 原理 13 仪器设备、试剂和材料 14 试剂配制 15 操作流程 5DB43/T 12382016 II 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。 本标准的某些内容可能涉及专利，本标准的发布机构不承担识别这
2、些专利的责任。 本标准由湖南省农业科学院蔬菜研究所提出。 本标准由湖南省农业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：湖南省农业科学院蔬菜研究所。 本标准主要起草人：刘峰、邹学校、戴雄泽、马艳青、李雪峰、张竹青、陈文超、郑井元、周书栋、杨博智、杨莎。 DB43/T 12382016 1 辣椒体细胞胚诱导技术规程 1 范围 本标准规定了一种提高辣椒体细胞胚发生频率的技术。 本标准适用于采用辣椒子叶外植体诱导体细胞胚发生。 2 原理 体细胞胚的诱导是辣椒再生体系的关键步骤之一，不同品种或品系体细胞胚的诱导率具有一定差异，但基础培养基和主要激素变化不大。植物的每一个细胞都具有经脱分化和再分化再生成为一
3、株完整植株的能力，即细胞的全能性。通过切割细胞全能性好的幼嫩组织经过脱分化产生愈伤，再诱导获得体细胞胚。体细胞胚又名胚状体，适宜条件下可以像种子一样发育为一株新的植株。 3 仪器设备、试剂和材料 3.1 主要仪器设备 自动电热压力蒸汽灭菌器（50126, 0.1450.165 Mpa）、超净工作台（100级0.5m）、烘箱（25180）、摇床（0300 rpm）、分析天平、电炉、冰箱（-204）。 3.2 主要试剂 MS培养基、琼脂、植物凝胶、蔗糖、2,4-D、6-BA、ABA、半胱氨酸、生物素、无水乙醇、盐酸和氢氧化钠。 3.3 主要耗材 0.22m水系滤膜、培养皿、移液枪枪头、封口膜（牛皮
4、纸）、直径10 cm的滤纸、一次性注射器和橡皮筋、耐高温塑料灭菌袋。 4 试剂配制 4.1 MS基础培养基 4.1.1 大量元素 成分 母液10（g/L） 工作液（mg/L） MgSO4.7H2O 3.7 370 CaCl2.2H2O 4.4 440 KH2PO4 1.7 170 KN03 19 1900 NH4NO3 16.5 1650 注1：-4冰箱保存备用，KN03和NH4NO3单独配成母液，方便使用，配置1000 mL培养基时，吸取10母液100 mL。 DB43/T 12382016 24.1.2 微量元素 成分 母液100（g/L） 工作液（mg/L） MnSO4.H2O 1.74
5、 17.4 KI 0.083 0.83 CoCl2.6H2O 0.0025 0.025 ZnSO4.7H2O 0.86 8.6 CuSO4.5H2O 0.0025 0.025 H3BO3 0.62 6.2 Na2MoO4.2H2O 0.025 0.25 注2：-4冰箱保存备用，配置1000mL培养基时，吸取100母液10mL。 4.1.3 铁盐 成分 母液100（g/L） 工作液（mg/L） FeSO4.7H2O 2.78 27.8 Na2-EDTA 3.73 37.3 注3：-4冰箱保存备用，配置1000 mL培养基时，吸取100母液10 mL。 4.1.4 改良有机成分 成分 母液100（
6、g/L） 工作液（mg/L） 肌醇 10 100 甘氨酸 0.2 2 VB1 0.1 10 VB6 0.05 0.5 烟酸 0.05 0.5 注4：-4冰箱保存备用，考虑保存时间，肌醇临用时称量固体补加到工作液，不配在有机成分母液中，配置1000 mL培养基时，吸取100母液10 mL。 4.2 pH试剂 4.2.1 0.5 mol/L NaOH溶液 称2.0g NaOH于烧杯中，用少量双蒸水溶解，倒入100mL容量瓶中，用去离子水定容至100 mL，常温保存，备用。 4.2.2 1mol/L NaOH溶液 称4.0g NaOH于烧杯中，用少量双蒸水溶解，倒入100mL容量瓶中，用去离子水定容
7、至100 mL，常温保存，备用。 4.2 植物生长调节剂 4.2.1 1mg/mL2,4-D溶液 称取10 mg 2,4-D于烧杯中，加入少量无水乙醇溶解后，倒入100 mL容量瓶中，最后定容至100 mL，后-4冰箱保存，备用。 DB43/T 12382016 3 4.2.2 1mg/mL 6-BA 称取100 mg 6-BA于烧杯中，加入13mL 0.5moL/L NaOH溶解后倒入100mL容量瓶中，定容至100mL， -20冰箱避光保存，备用。 4.2.3 1 mg/mLABA 称100 mg于烧杯中，加入少量双蒸水溶解后，倒入100mL容量瓶中，定容至100mL， -20冰箱避光保存
8、，备用。 4.3 2.5 mg/mL半胱氨酸 取0.25g半胱氨酸于烧杯中，加入少量3mL发烟HCl溶解后，倒入100mL容量瓶中，定容至100mL，-20冰箱，避光保存，备用。 4.4 1mg/mL生物素溶液 称0.1g生物素于容量瓶中，加入少量5070双蒸水溶解后，用5070去离子定容至100mL，冷却后，-20冰箱保存备用（使用时需水浴加热使其完全溶解后，经0.22m水系滤膜过滤除菌加入培养基）。 4.5 无菌材料和试剂 4.5.1 无菌纸 用牛皮纸将直径10 cm的滤纸包裹严实，高压灭菌锅中121灭菌30 min，烘干备用。 4.5.2 无菌枪头 用剪刀将1000 mL蓝色枪头的尖端剪
9、去0.30.5 cm，放入枪头盒，高压灭菌锅中121灭菌30min，烘干备用。 4.5.3 无菌密封瓶 将100 mL的干净锥形瓶用牛皮纸盖好，橡皮筋扎紧后，高压灭菌锅中121灭菌30 min，烘干备用。 4.5.4 无菌水 三角瓶中装入去离子水，高压灭菌锅中121灭菌30min，烘干备用。 4.6 消毒试剂 4.6.1 0.1%HgCl2（w/v）升汞溶液 称取1 mg HgCl2于烧杯中，加入少量无水乙醇溶解后，倒入1 L量筒中，用去离子水定容至1 L，常温保存，备用。 4.6.2 75%乙醇（v/v）溶液 量取750 mL无水乙醇，用去离子水稀释至1000 mL，常温保存，备用。 4.7
10、 培养基配制 DB43/T 12382016 44.7.1 MS1培养基配制 培养基配方： 1/2MS+蔗糖30 g/L+琼脂8 g/L。配制方法： a） 量取大量元素母液50 mL，微量元素、铁盐和改良有机成分母液各5 mL，加入蔗糖30g，琼脂8g，用去离子水稀释至1L； b） 电炉煮至沸腾，用0.5 mol/L的NaOH溶液调节PH至5.65.8； c） 分装于三角瓶中（1520mL/瓶），高压灭菌锅中121灭菌30 min，静置凝固后常温保存备用。 4.7.2 MS2培养基 培养基配方：MS+2,4-D 2 mg/L+Biotin 1 mg/L+半胱氨酸5 mg/L+蔗糖30 g/L+
11、植物凝胶2.5g/L。配制方法： a） 量取大量元素母液100 mL，微量元素、铁盐和改良有机成分母液各10 mL，加入蔗糖30 g，琼脂8g，用去离子水稀释至1L。 b） 用0.5 mol/L的NaOH溶液调节PH至5.65.8，装于1L锥形瓶中（ 1520）mL/瓶），牛皮纸封口后，高压灭菌锅中121灭菌30 min。 c） 经过滤除菌的方式加入1 mg/L生物素溶液1 mL（水浴加热完全溶解），2.5 mg/L半胱氨酸2 mL（同时加入约1300L1moL/L的NaOH溶液保证培养基PH不变），摇匀后分装于三角瓶中（约30 mL/瓶），避光保存备用。 4.7.3 MS3培养基 培养基配方
12、：MS+2,4-D 1 mg/L+半胱氨酸5 mg/L+蔗糖35 g/L+植物凝胶2.5 g/L。配制方法： a） 量取大量元素母液100 mL，微量元素、铁盐和改良有机成分母液各10 mL，加入1 mg/mL2,4-D溶液1 mL、蔗糖35 g和植物凝胶2.5 g，用去离子水稀释至1L。 b） 用0.5 mol/L的NaOH溶液调节PH至5.25.4，装于1L锥形瓶中（ 1520） mL/瓶），牛皮纸封口后，高压灭菌锅中121灭菌30 min。 c） 经过滤除菌的方式加入2.5 mg/L半胱氨酸2 mL（同时加入约1300L1moL/L的NaOH溶液保证培养基PH不变），摇匀后分装于空三角瓶
13、中（约30 mL/瓶），避光保存备用。 4.7.4 MS4培养基 培养基配方：MS+2,4-D 1 mg/L+6-BA 1.5 mg/L+Biotin 1 mg/L+L-脯氨酸100 mg/L+麦芽提取物100 mg/L+蔗糖40 g/L。配制方法： a） 量取大量元素母液100 mL（不含KNO3， NH4NO3的浓度为10 M/L），微量元素、铁盐和改良有机成分母液各10 mL，加入L-脯氨酸100 mg、麦芽提取物100 mg、蔗糖40 g和植物凝胶2.5 g，双蒸水定容至1 L. b） 用0.5 moL/L的NaOH溶液调节PH至5.65.8，装于1 L锥形瓶中（1520mL/瓶），牛
14、皮纸封口后，高压灭菌锅中121灭菌30 min。 c） 经过滤除菌的方式加入1 mg/L生物素溶液1 mL（水浴加热完全溶解），再加入1 mg/mL 6-BA 1.5 mL，摇匀后分装于空三角瓶中（约30 mL/瓶），避光保存备用。 4.7.5 MS5培养基 培养基配方：MS+ABA 0.5 mg/L+蔗糖30 g/L。配制方法： a） 量取大量元素母液100 mL（NH4NO3的浓度为10 M/L），微量元素、铁盐和改良有机成分母液各10mL，加入蔗糖30 g和植物凝胶2.5 g，用去离子水稀释至1L。 DB43/T 12382016 5 b） 用0.5 mol/L的NaOH溶液调节PH至5
15、.65.8，装于1 L锥形瓶中（2030 mL/瓶），牛皮纸封口后，高压灭菌锅中121灭菌30min。 c） 经过滤除菌的方式加入0.5 mg/mL ABA 1 mL，摇匀，分装于空三角瓶中（约30 mL/瓶），避光保存备用。 5 操作流程 5.1 无菌苗的培育 将装有MS1培养基的三角瓶、镊子、酒精灯、无菌水等放入超净工作台，紫外灯下消毒（12） h。取辣椒种子，置于超净工作台内，用0.1v/v %升汞消毒（810） min，无菌水冲洗（46） 次。将灭菌辣椒种子播种到pH值为5.8的MS1培养基中（每瓶1012粒）d） 在（26+2） ，（16 /8） h光照条件下培养（1013） d得到
16、无菌苗。 5.2 外植体的选择和愈伤组织的诱导 将装MS2培养基的三角瓶、无菌纸、镊子、解剖刀、酒精灯、无菌水等放入无菌操作台，紫外灯下消毒（12） h。用无菌镊子将无菌苗拔出放至无菌纸上，用解剖刀将子叶和下胚轴切成（0.30.5）cm的小段的置于pH值为5.8的MS2培养基中。在（26+2）黑暗条件下培养（1013）d，得到愈伤组织。 5.3 体细胞胚的诱导 将装有MS3培养基的罐头瓶、无菌纸、镊子、解剖刀、酒精灯、无菌水等放入无菌操作台，紫外灯下消毒（12）h。用无菌镊子挑选淡黄色、松散的胚性愈伤组织放至无菌纸上，用解剖刀将愈伤组织与子叶和下胚轴切分，并将愈伤组织转至pH值为5.4的MS3
17、培养基诱导体细胞胚。在（26+2）黑暗条件下，在摇床上（100 rpm）进行悬浮培养。 5.4 体细胞胚的继代与增值 将装有MS4培养基的三角瓶（100 mL）、含有体细胞胚的三角瓶、镊子、无菌纸、灭菌蓝色枪头、1000 ml移液器、废液瓶、酒精灯等放入无菌操作台。用移液器吸取悬浮体细胞胚及培养液（12） mL转移至pH值为5.8的MS4培养基中继代，悬浮细胞每（1315）d进行一次继代。在100 rpm摇床上，（26+2） 黑暗条件下培养，直至获得大量体细胞胚。 5.5 成熟体细胞胚的获得 将装有MS5培养基的三角瓶（100 mL）、含有体细胞胚的三角瓶、镊子、无菌纸、灭菌蓝色枪头、1000ml移液枪、废液瓶、酒精灯等放入无菌操作台，紫外灯下消毒（12） h。用移液器吸取锥形瓶中悬浮体细胞胚及培养液（12）mL转移至pH值为5.8的MS5培养基中。在100 rpm摇床上，（26+2）黑暗条件下培养，直至获得成熟体细胞胚。
