1、ICS 65.020.30 B 44 备案号：32098-2012 DB11 北京市地方 标准 DB11/T 828.32011 实验用小型猪 第 3部分：遗传质量控制 Experimental minipig Part 3：Genetic quality control 2011 - 11 - 10发布 2012 - 03 - 01实施 北京市质量技术监督局 发布DB11/T 828.3 2011 I 目 次 前言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语和定义 . 1 4 遗传分类及命名 . 1 5 繁殖 . 2 6 近交系实验用小型猪的遗传质量监测 . 3 7 封
2、闭群实验用小型猪的遗传质量监测 . 3 附录 A（规范性附录） 近交系实验用小型猪的微卫星 DNA标记检测方法 5 附录 B（规范性附录） 封闭群实验用小型猪的微卫星 DNA标记检测方法 9 DB11/T 828.3 2011 II 前 言 DB11/T 828的本部分按照 GB/T 1.12009 给出的规则起草。 DB11/T 828实验用小型猪分为六个部分： 第 1部分：微生物学等级及监测； 第 2部分：寄生虫学等级及监测； 第 3部分：遗传质量控制； 第 4部分：病理学诊断规范； 第 5部分：配合饲料； 第 6部分：环境及设施。 本部分为 DB11/T 828的第 3部分。 本部分由北
3、京市科学 技术委员会提出并归口。 本部分由北京市科学 技术委员会组织实施。 本部分起草 单位： 中国农业科学 院北京畜牧兽医研究所、首都医科大 学、中国人民解放军军事医学 科学院、吉林大学。 本部分主要 起草人： 李奎、陈振 文 、杨述林、吴艳花、冯书堂、杜 小 燕、牟玉莲、董罡、公维华、 任文陟、张宁波、徐玲玲。 DB11/T 828.3 2011 1 实验用小型猪 第3 部分：遗传质量控制 1 范围 DB11/T 828的本部分规定 了 实验用小型猪的遗传分类 、 繁殖方法和近交系及封闭群的遗传质量标 准。 本部分适用 于实验用小型猪的遗传质量控制。 2 规范性引用文件 下列文件对于 本文
4、件的 应 用 是必不可少 的。 凡是注日期 的引用文件 ，仅所注日期的 版本适用 于本文 件。凡是不注日期的引用文件 ，其最新版 本（包括所有 的 修改单 ）适用于 本文件。 GB 14923 实验动物 哺乳类动 物的遗传质量控制 3 术语和定义 下列术语和定义适用 于本文件。 3.1 实验用小型猪 experimental minipig 经 人 工 饲 育 ，对其 携带的病 原 微生物和寄生虫实 行控制 ， 遗传背景明确或者来源清楚，12 月龄体 重不超过 35kg， 用 于科 学 研究、 教 学 、生 产 和检定 以及 其 他 科 学实验的小型猪。 3.2 近交系 inbred stra
5、in 经至少连续 20代 的 全同胞兄妹 交配培育而成， 品系内 所有个体都可 追溯到 起源于第 20代或以后代 数的一对共同祖先。 经连续 20代以上亲代与子代交配和全同胞兄妹 交配 有等同效果 。 近交系的近交系数（inbreeding coefficient） 应大于 99%。 3.3 封闭群（远交群） closed colony （outbred stock ） 以非近亲交配方式进行 繁殖生 产的实验用小型猪 种群 ， 在不从外 部引入新 个体的条 件下， 至 少连续 繁殖 4代以上 。 4 遗传分类及命名 DB11/T 828.3 2011 2 4.1 遗传分类 根据遗传 特点的 不
6、同，实验用小型猪分为近交系和封闭群。 4.2 命名 4.2.1 近交系命名 近交系一般以 大 写英 文字母命名 ， 亦 可 以用 大 写英 文 字母加阿拉伯数字命名 ， 符号应 尽量简短。 如 WZSP等。 4.2.2 近交代数 近交系的近交 代数用 大写英文 字母F表示 。例如当一 个近交系的近交代数 为30代时 ，写成（F30）。 4.2.3 其它近交系 亚系，重组 近交系， 同源突变 近交系， 同源导入 近交系的定义和命名按照 GB 14923执行。 4.2.4 封闭群命名 封闭群的命名按照GB 14923执 行。 5 繁殖 5.1 近交系的繁殖 5.1.1 原则 选择近交系实验用小型猪
7、繁殖方法的原 则是保持 近交系小型猪的 同基因性及 基因纯 合性。 5.1.2 引种 作为繁殖用 种子的近交系实验用小型猪，应 来 自 于 近交系的基础 群或血缘扩 大 群 ， 遗传 背景明确 ， 有完整的资 料（包括 品系名称 、近交代数 、 遗传 基因 特点及主要 生物学特 征等）。 5.1.3 方法 可分为基础 群（ foundation stock） 、 血缘扩 大群（ pedigree expansion stock）和生产群（ production stock）。当近交系小型猪生产供应 数量不是很 大时 ，一般不设血缘扩 大 群 ，仅 设 基础群和生产群。 基 础群、血缘扩 大 群
8、和生 产 群的 具体繁殖方 式 按照 GB 14923执行。 5.2 封闭群的繁殖 5.2.1 原则 选择封闭群实验用小型猪繁殖方法的原则是保持封闭群小型猪的遗传异质性及基因多态性，避免 近交系数随 繁殖代数 增加而过 快上升。 5.2.2 引种 5.2.2.1 作为繁殖用 种子的封闭群小型猪 应 遗传 背景明确或来源清楚，有 完整的资 料（ 包括 种群名称、 来源、遗传 基因特点 及主要生物学特性等）。 DB11/T 828.3 2011 3 5.2.2.2 根据繁殖方 式， 在保证每代近交系数增 量不大于 1%的前 提下， 决 定最小引 种规模。 如采用循 环交配方式 ，引种数 量不得少于
9、 13对无血缘关 系（ 三代以内无 共同祖先 ）的公母 猪；若采 用随机交配 方 式 ， 引 种数 量 不 得少于 25对 无血缘关 系的公 母猪。 5.2.3 方法 封闭群应足够大，以保持封闭群实验用小型猪的遗传 基因的稳定，并尽量避免近亲交配。 具体繁 殖方法按照 GB 14923执行。 6 近交系实验用小型猪的遗传质量监测 6.1 检测方法 采用微卫星 DNA标记检测方法。 具体方法 执行附录A 。 6.2 抽样 对基础群，凡 在子代 留有种猪的 双 亲动 物都应进行 检测。 对生产群， 按表1要求 从每个近交系中随机抽取 非同 窝成年猪，公 母 各半 。 表1 近交系实验用小型猪遗传检
10、测抽样要求 生产 群中 种母 猪数 量 抽样 数量 少于 100头 6头 大于 100头 不少于 6% 6.3 结果判定 近交系实验用小型猪遗传检测 结果的判 定按表2 执行 。 表2 近交系实验用小型猪遗传检测结果判定 检测 结果 判定 与标 准遗传 概貌完 全一 致 未发现 遗传 变异 有 一个 位点 的标记 基因 与标 准遗传 概貌 不一 致 遗传 发生 变异 6.4 判定结论 所有样品检测 位 点 的等 位 基因 都符合品 系的特征 ， 没 有新的等位 基因出现 为合格实验用小型猪近交 系，否则判 为不合格 。 6.5 检测时间间隔 近交系实验用小型猪生 产 群 每年 至 少 进行一次
11、遗传质量检测。 7 封闭群实验用小型猪的遗传质量监测 7.1 检测方法 DB11/T 828.3 2011 4 采用微卫星DNA标记检测方法。 具体方法 执行附录 B。 7.2 抽样 按表 3要求 从每个封闭群中随机抽取非同 窝 成 年猪 ，公 母 各半。 表3 封闭群实验用小型猪遗传检测抽样要求 群体数 量 抽样 数量 少于 100头 不少于 15头 大于 100头 不少于 30头 7.3 结果判定 群体内遗传 变异采用 平均杂合 度指标或 群体平衡状态 方法进行评价 。 当 平均杂合 度在0.5 0.7时， 且期望杂 合度与观 测杂 合度经卡方检验无明 显差异时 ， 群体为合 格 的 封闭
12、群实验用小型猪群 体 。 或 用群 体 是 否达 到 平衡状态 来 判 定 ， 如果 没有达到 平衡状态 ， 说 明 群 体的 基 因频率或基因 型 频率发 生 变 化， 该 封闭群实验用小型猪群体判为 不合格。 具体方法 执行附录B 。 7.4 检测时间间隔 封闭群实验用小型猪生 产 群 每两年至少 进行一次 遗传质量检测。 DB11/T 828.3 2011 5 A A 附 录 A （规范性附录） 近交系实验用小型猪的微卫星 DNA标记检测方法 A.1 微卫星分子标记检测的原理 采集 近交系实验用小型猪的 血液或 耳组织，提 取基因 组DNA。 对 特 定的微卫星标记 座位进行PCR 扩增
13、，通过 遗传分析仪 检测各 座位基因 的峰形和 大小 ，确定各近交系的微卫星标记的遗传概貌 。 A.2 仪器设备 A.2.1 常压电泳仪 。 A.2.2 4、20冰箱。 A.2.3 低温高速离心 机 。 A.2.4 水浴锅。 A.2.5 感量为0.0001g的分析天 平 。 A.2.6 pH计。 A.2.7 紫外分光光 度仪。 A.2.8 PCR仪。 A.2.9 遗传分析仪 。 A.3 微卫星DNA标记检测方法 A.3.1 样本的采集 A.3.1.1 耳静脉或前 腔静脉采血 2ml，加 等量的血液 裂 解液 。 A.3.1.2 采集大小0.5g的耳 组织样，放 入 75%乙醇 保 存。 A.3
14、.2 基因组DNA的 提取 用苯酚氯仿 法或试剂盒 提 取基因 组 DNA。 A.3.3 微卫星标记 位点 用10个分布 于猪单倍 体10条主要 染色体上 的微卫星 位点 检测近交系小型猪的遗传概貌 。 各 微卫星位 点的染色体 位置、等 位基因数 、引物序 列及荧光 标记 ，PCR反应的 Tm值、镁离 子 浓 度见 表 A.1。 A.3.4 PCR扩增 A.3.4.1 PCR扩增 的体系 PCR总反应体 积为 15l,其中 含 1PCR buffer,200 M dNTPs, 各 400pM的 上 下游 引物，MgCl 2（浓 度见表 A.1） ， 0.1l (5U/l) 的 TaqTM,1
15、00ng的 基因 组 DNA。 PCR反 应程序为 94C, 4min ； 94C， 30s； 退火，30s； 72C,30s,30 个循 环，72C 延伸 7min。 A.3.4.2 PCR产物 的检测 DB11/T 828.3 2011 6 PCR产 物 ， 以 2 的 琼脂糖检测 扩增效率 。凝胶成 像 系统记录检测 结 果 。 A.3.5 个体基因型的判定 A.3.5.1 PCR产物 的变性 根据琼脂糖 检测的结 果，对 PCR产 物进行稀释 。 若 2%的 琼脂糖检测的 条带亮 度基本相 同， 即PCR的 扩 增效率基本 相同， 则FAM、 HEX、 TAMRA三 种标记的 三 个位
16、 点 的 PCR产 物分别取 1ul混合 ， 加到每 孔含8.5ul 的 甲酰胺和 内标的96 孔板上 （860ul甲酰胺 加 10ul内 标， 混匀， 分 装到96孔板 上 ） ， 95 C变 性5分钟 ， 迅 速放在冰上 。待96孔板降温后 ，用铝箔纸 包 好 ，4 保 存 备 用。 A.3.5.2 基因型的判定 含 变 性 后 的 PCR产物的96孔板 放 入 遗传分析仪内进行 分析，原始峰图 用基因分型 软 件 进行 分析，确 定特定位点 各个体的 峰形和大 小，判定个 体 的 基因 型。 A.3.6 结果判定 所有样品检测位 点的等位 基因都符合 品系的特征 (见 表A.2)，没有新
17、 的等位基因 出 现 为合 格实验用 小型猪近交系 ,否 则 判为 不 合 格。 A.4 结果报告 根据判定结 果对被检测的实验用小型猪群 体 做 出检测 报告。 DB11/T 828.3 2011 7 表A.1 各微卫星座位 的 染色体位置、等位基因 数、等位基因片段范围、荧光标记 、两侧引 物序列（ 左侧：F ，右侧 ： R） 、退火温度和 镁离子浓度 座 位名 称 染色 体 位置 等位 基 因数 等位 基因 范围 bp 5荧光 标记 引物 序列 5 3 Tm Mg2+ (mM) CGA 1q 12 250-320 FAM F-ATA GAC ATT ATG TAA GTT GCT GAT
18、 R-GAA CTT TCA CAT CCC TAA GGT CGT 55 2.5 SW240 2P 8 96-115 TAMRA F-AGA AAT TAG TGC CTC AAA TTG G R-AAA CCA TTA AGT CCC TAG CAA A 55 1.5 SW72 3P 8 100-116 TAMRA F-ATC AGA ACA GTG CGC CGT R-GTT TGA AAA TGG GGT GTT TCC 55 1.5 S0005 5q 10 205-248 FAM F-TCC TTC CCT CCT GGT AAC TA R-GCA CTT CCT GAT TCT G
19、GG TA 55 3.0 S0090 12q 4 244-251 TAMRA F-CCA AGA CTG CCT TGT AGG TGA ATA R-GCT ATC AAG TAT TGT ACC ATT AGG 55 1.5 SW769 13 7 106-140 HEX F-GGT ATG ACC AAA AGT CCT GGG R-TCT GCT ATG TGG GAA GAA TGC 55 3.0 SW857 14 6 144-160 TAMRA F-TGA GAG GTC AGT TAC AGA AGA CC R-GAT CCT CCT CCA AAT CCC AT 55 1.5 S0
20、355 15 14 243-277 HEX F-TCT GGC TCC TAC ACT CCT TCT TGA TG R-GTT TGG GTG GGT GCT GAA AAA TAG GA 55 3.0 SW24 17 8 96-121 FAM F-CTT TGG GTG GAG TGT GTG C R-ATC CAA ATG CTG CAA GCG 55 1.5 S0218 X 8 164-184 TAMRA F-GTG TAG GCT GGC GGT TGT R-CCC TGA ACC CTA AAG CAA AG 55 1.5 DB11/T 828.3 2011 8 表A.2 五指山小
21、型猪近交系 、广西巴马 小型猪和 贵州小型猪近交系培育过程中， 遗传质量控制的微卫星座位 及优势等位基因 等位 基因 座位 等位 基因 座位 等位 基因 座位 等位 基因 座位 等位 基因 座位 等位 基因 座位 等位 基因 座位 等位 基因 座位 等位 基因 座位 等位 基因 座位 群体 CGA SW769 SW857 S0005 SW240 S0355 SW72 S0090 S0218 SW24 五指 山小型猪近交系 189 0.023 105 0.093 150 0.163 238 0.671 116 0.171 258 0.750 106 0.588 241 0.756 173 0.0
22、12 104 0.631 199 0.872 129 0.907 158 0.837 124 0.537 266 0.138 114 0.238 247 0.012 179 0.547 203 0.023 181 0.419 293 0.081 等位 基因频率 合计 1.000 0.907 1.000 0.671 0.707 0.888 0.825 0.756 0.547 0.631 广西巴马 小型猪 271 0.490 123 0.194 146 0.146 216 0.223 94 0.531 258 0.083 110 0.698 241 0.032 167 0.115 102 0.75
23、0 277 0.281 127 0.806 154 0.573 226 0.660 98 0.333 260 0.427 120 0.083 243 0.117 173 0.740 104 0.021 297 0.229 104 0.115 262 0.427 247 0.489 179 0.125 249 0.117 187 0.021 等位 基因频率 合计 1.000 1.000 0.719 0.883 0.979 0.854 0.781 0.606 0.854 0.750 贵州 小型猪 271 0.011 105 0.291 156 0.167 202 0.558 96 0.227 25
24、2 0.183 102 0.170 247 0.045 181 0.151 100 0.114 283 0.136 121 0.267 160 0.452 204 0.244 102 0.182 254 0.098 249 0.580 187 0.186 104 0.114 285 0.364 129 0.093 166 0.202 214 0.186 272 0.110 112 0.625 253 0.375 195 0.023 108 0.216 305 0.295 133 0.151 274 0.341 118 0.045 197 0.500 112 0.136 139 0.081 14
25、5 0.116 等位 基因频率 合计 0.795 0.907 0.821 0.988 0.409 0.732 0.841 0.955 0.709 0.466 DB11/T 828.3 2011 9 附 录 B （规范性附录） 封闭群实验用小型猪的微卫星 DNA标记检测方法 B.1 基因组DNA的 提取 用苯酚氯仿 法或试剂盒 提 取基因 组 DNA。 B.2 微卫星位点 用 25个分布 于猪 17条常染色 体和 X性染色体上 的微卫星位点检测封闭群小型猪的遗传概貌。 各微 卫星位点的名 称 、 引物 序列、 在 染色体位 置、 等位基因 数 、 PCR反 应 的 Tm值 、 镁离子浓度及等 位
26、基因 分布范围见 表 B。 B.3 PCR扩增 B.3.1 PCR扩增的体 系 PCR总反应体 积为 15l,其中 含 10PCR buffer:1.5 l， 上 下 游引物(100 pmol/L) 各 1L ,4 dNTP 100mol/L :1 L ,Taq 酶 1U:1L ,50 ng 100 ng 基因组 DNA:1L , 纯 水 (ddH2O) :8.5L 。 PCR反应程序 为：95 预变性, 4min；94 变 性， 30s； 退火温度 （各位点 退火温度 参见表 B），30s ； 72延伸，30s；35 个循环；72 继 续延伸 7min；扩增 产 物 4 保存 。 B.3.2
27、 PCR产物的检测 PCR产物， 经 1.5的 琼脂糖凝胶电泳以 及凝胶 成像 系统拍照检测 扩增结 果。 B.3.3 扩增产物的STR扫描 扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳检测 确 保扩增出目的片 断后，选择分别以FAM、HEX、TAMRA标记的三 个位点的扩增 产 物 ，以 1： 3： 5体 积 比 混合 ， 取 1 l上样 进行STR扫描 。 B.4 STR扫描结果的判读与统计分析 B.4.1 STR扫描结果的判读 扫描结果出 现两种波 形：一种 为纯合基因 型 ， 只有 一个 主波；另 一种为杂 合基因型 ，有两个 主波。 同时，根据 软件读出 波峰处的 扩增产物的 bp数 。 由基因分型
28、软件读出 每个样本 在每个微卫星位点 的扩增 片 断 大 小。 每个位点 的等位 基因根据 扩增片 断从小到大 顺序排列 纪录为 a,b,c,d等。 B.4.2 运用群体遗传分析软 件对数据进行统计 分析 将所有样本的 每 个微卫星位点 的基因型 以 ab,bb等形 式输入群体 遗传分析 软件的数据 文件， 计算样 品在各微卫星 位 点上 的基因频率 、平均观察等 位基因 数、 平均 有效等位 基因数 （Ne ） 、 相 隆指数 、 平均 杂合度（H）等。 B.5 结果判定 平均杂合度 在 0.5 0.7时， 且期望杂 合度与 观测杂 合度经卡方检验无明 显差异时 ，群体为合 格 的 封闭群实
29、验用小型猪群 体 。 或者 ，首 先 得 到 各 个 位 点上 各基因频率 、 基因 型频率的实 际 值 ， 然 后 可 计算 出 基因频率 和基因型 频率的预 期值。用实 际值和预 期 值比较， 通过 卡方检验，可 知被监测群体是 否达到DB11/T 828.3 2011 10 平衡状态。 如果 没 有 达到 平衡状态 ， 说 明 群体 的 基因频率或基因 型频率发 生变化， 该 封闭群实验用小型 猪群体判为 不合格。 B.6 结果报告 根据判定结 果对被检测的封闭群实验用小型猪群 体做 出检测报告 。 DB11/T 828.3 2011 11 表 B 各微卫星 座位 的引物序列、染色体位置
30、、最佳扩增条件、等位基因 数及等位基因分布范围 位点 引物 序列(5 -3 ) 所 在染 色 体 镁离 子浓 (mmol/L) 退火温 度 () 等位 基 因数 等位 基因 范围 SW974 GGTGAAGTTTTTGCTTTGAACC GAAAGAAATCCAAATCCAAACC 1 2.0 58 17 129-175 S0091 TCTACTCCAGGAGATAAGCCAGAT CAGTGACTCCATGCACAGTTATGA 2 1.5 55 14 96-174 SW240 AGAAATTAGTGCCTCAAATTGG AAACCATTAAGTCCCTAGCAAA 2 1.5 58 11
31、 92-114 SW1066 GCAGGATGAACCACCCTG CTCTTGAGGCAACCTGCTG 3 2.0 60 19 166-214 SW1089 TTTTCCCCTTCACTCACCC GATCAAAGTCCCTTACTCCGG 4 1.5 58 10 142-190 S0005 TCCTTCCCTCCTGGTAACTA GCACTTCCTGATTCTGGGTA 5 2.0 54 11 204-244 SW1057 TCCCCTGTTGTACAGATTGATG TCCAATTCCAAGTTCCACTAGC 6 2.0 58 14 142-191 SW632 TGGGTTGAAA
32、GATTTCCCAA GGAGTCAGTACTTTGGCA 7 2.0 54 9 148-173 OPN CCAATCCTATTCACGAAAAAGC CAACCCACTTGCTCCCAC 8 2.0 59 12 138-170 SW29 AGGGTGGCTAAAAAAGAAAAGG ATCAAATCCTTACCTCTGCAGC 8 2.0 61 12 133-187 SW911 CTCAGTTCTTTGGGACTGAACC CATCTGTGGAAAAAAAAAGCC 9 2.0 60 14 151-178 SW511 AAGCAGGAATCCCTGCATC CCCAGCCACCAGTCTGA
33、C 9 1.5 62 12 161-196 SWr158 TCCAATTCAACTCCTGGCTC GAATGTGCACATACCACATGC 10 2.0 60 18 158-200 SW951 TTTCACAACTCTGGCACCAG GATCGTGCCCAAATGGAC 10 1.5 58 14 108-142 SW271 TTCCAGTGGCTTTCTGTGC CATTCATTCCCAGTGAAACTTG 11 1.5 58 13 111-144 S0386 TCCTGGGTCTTATTTTCTA TTTTTATCTCCAACAGTAT 11 2.0 48 12 155-178 S00
34、68 CCTTCAACCTTTGAGCAAGAAC AGTGGTCTCTCTCCCTCTTGCT 13 2.0 62 10 210-256 SWr1008 ACAGCCACCAACAGTGTTTG GAACTTCCATATGCTGCAAGTG 13 2.0 62 16 98-256 S0007 TTACTTCTTGGATCATGTC GTCCCTCCTCATAATTTCTG 14 2.0 54 15 142-192 SW857 TGAGAGGTCAGTTACAGAAGACC GATCCTCCTCCAAATCCCAT 14 2.0 58 16 129-173 SWr312 ATCCGTGCGTG
35、TGTGCAT CTGGTGGCTACAGTTCCGAT 15 1.5 64 11 116-136 SW81 gatctggtcctgcacaggg GGGGCTCTCAGGAAGGAG 16 1.5 60 8 128-144 SWr1120 CAAATGGAACCCATTACAGTCC ACTCCTAGCCCAGGAGCTTC 17 1.5 60 11 147-178 S0062 AAGATCATTTAGTCAAGGTCACAG TCTGATAGGGAACATAGGATAAAT 18 2.0 56 12 144-204 S0218 GTGTAGGCTGGCGGTTGT CCCTGAAACCTAAAGCAAAG X 1.5 54 11 158-196 _
