1、ICS 65.020.30 B 44 备案号：32096-2012 DB11 北京市地方 标准 DB11/T 828.12011 实验用小型猪 第 1部分：微生物学等级及监测 Experimental minipig Part 1：Microbiological standards and surveillance 2011 - 11 - 10发布 2012 - 03 - 01实施 北京市质量技术监督局 发布DB11/T 828.1 2011 I 目 次 前言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语和定义 . 2 4 微生物学等级分类 . 2 5 检测要求 . 2 6
2、 检测程序 . 3 7 检测方法 . 4 8 检测规则 . 5 9 结果判定 . 6 10 判定结论 6 附录 A（资料性附录） 猪圆环病毒 2型 ELISA抗体检测 7 DB11/T 828.1 2011 II 前 言 DB11/T 828的本部分按照 GB/T 1.12009 给出的规则起草。 DB11/T 828实验用小型猪分为六个部分： 第 1部分：微生物学等级及监测； 第 2部分：寄生虫学等级及监测； 第 3部分：遗传质量控制； 第 4部分：病理学诊断规范； 第 5部分：配合饲料； 第 6部分：环境及设施。 本部分为 DB11/T 828的第 1部分。 本部分由北京市科学 技术委员会
3、提出并归口。 本部分由北京市科学 技术委员会组织实施。 本部分起草 单位： 中国食品药品 检定研究院、中国动 物疫病预防 控制中心、中国人民解放军军事医 学科学院实验 动 物 中心、北京实验动物 研究中心 。 本部分主要起草人： 贺争鸣、田克恭、 范薇、巩薇、遇秀玲、付瑞、卢胜明 。 DB11/T 828.1 2011 1 实验用小型猪 第1 部分：微生物学等级及监测 1 范围 DB11/T 828的本部分规定 了 实验用小型猪微生物学等级分类、检测要求、检测程序、检测方法、 检测规则、 结果判定 、判定结论等。 本部分适用 于实验用小型猪微生物学等级监测。 2 规范性引用文件 下列文件对于
4、本文件的 应 用 是必不可少 的。 凡是注日期 的引用文件 ，仅所注日期的 版本适用 于本文 件。凡是不注日期的引用文件 ，其最新版 本（包括所有 的 修改单 ）适用于 本文件。 GB/T 14926.4 实验 动物 皮肤 病原真菌 检测方法 GB/T 14926.8 实验 动物 支原 体检测方法 GB/T 14926.46 实验 动物 钩端螺旋体检测方法 GB/T 16551 猪 瘟 诊断 技 术 GB/T 18090 猪 繁殖与呼吸综 合症诊断方法 GB/T 18638 流行性 乙型脑炎 诊断技术 GB/T 18641 伪狂犬 病诊断技 术 GB/T 18646 动 物 布鲁氏菌病诊断技术
5、 GB/T 18935 口 蹄 疫诊断技术 GB/T 19200 猪 水泡 病诊断技 术 GB/T 19915.1 猪链球 菌 2型平板和试管凝集试 验操作 规程 GB/T 19915.2 猪链球 菌 2型分 离鉴定 操作规程 GB/T 19915.3 猪链球 菌 2型 PCR定型检测技术 GB/T 19915.7 猪链球 菌 2型荧光 PCR检测方法 GB/T 21674 猪圆环病毒聚合 酶链反应 试验方法 GB/T 22333 日 本 乙型 脑炎病毒 反转录 聚合酶链反 应试 验方法 GB/T 22915 口 蹄 疫病毒荧光 RT-PCR检测方法 GB/T 22917 猪 水泡 病病毒荧光
6、 RT-PCR检测方法 NY/T 537 猪放线杆 菌胸膜肺炎 诊断技 术 NY/T 541 动物疫病实验室检验 采样方法 NY/T 545 猪痢疾诊断 技 术 NY/T 546 猪萎缩性 鼻炎诊断 技术 NY/T 548 猪传染性 胃肠炎诊断 技 术 NY/T 550 动物和动 物产品沙门氏菌检测方法 NY/T 564 猪巴氏杆 菌病诊断 技术 NY/T 679 猪繁殖和 呼吸综合 症免疫酶试 验方法 DB11/T 828.1 2011 2 SN/T 1379.1 猪瘟单克 隆 抗体 酶联免疫吸 附 试验 SN/T 1445 动物流行 性乙型脑炎 微量血凝抑制 试验 SN/T 1446.1
7、猪传染 性胃肠炎阻 断 酶联免 疫吸 附试 验 SN/T 1919 猪细小病毒病红细胞凝集抑 制试验 操作 规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用 于本文件。 3.1 实验用小型猪 experimental minipig 经 人 工 饲 育 ，对其 携带的病 原 微生物和寄生虫实 行控制 ， 遗传背景明 确或者来源清楚，12 月龄体 重不超过 35kg， 用 于科学研究、 教 学 、生 产 和检定 以及 其 他 科学实验的小型猪。 3.2 普通级小型猪 conventional (CV) minipig 不携带 所规定的 重要人兽共患病病 原和猪烈 性传 染病病原。 3.3 清洁级小型猪
8、clean (CL) minipig 除普通级应 排除的病 原外，不 携带所规定的对猪 危害大 和 对 科学 研究干扰 大的病原 。 3.4 无特定病原体级小型猪 specific pathogen free (SPF) minipig 除清洁级应 排除的病 原外，不 携带所规定的潜在感 染或 条 件 致 病和 对 科学实验干扰 大的病原 。 4 微生物学等级分类 实验用小型猪微生物学等级分为 普通级 、清洁级和 无特 定病原体级。 5 检测要求 5.1 临床观察 外观检查无异常。 5.2 微生物检测项目 各等级实验用小型猪病 原 微生物检测项目见表1 。 DB11/T 828.1 2011
9、3 表1 各等级实验用小型猪病原微生物检测项目 动 物等级 微生物 检测要求 无 特 定 病 原 体 级 清 洁 级 普 通 级 口蹄 疫病毒 Foot and mouth disease virus 猪 瘟病毒 Classical swine fever virus 猪 繁殖与呼吸综 合征 病毒 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus 乙 型脑炎 病毒 Japanese encephalitis virus 布鲁氏 菌 Brucella spp 皮肤 病原真菌 Pathogenic dermal fungi 钩端螺旋体 Lept
10、ospira spp 伪狂犬 病病毒 Pseudorabies virus 猪 痢疾 蛇样 螺旋 体 Serpul- Mahyodysenteriae 支 气管 败血 波氏杆菌 Bordetella bronchiseptica 多杀 巴氏杆 菌 Pasteurella multocida 肺炎 支原体 Mycoplasma hyopneumoniae 猪细 小病毒 Porcine parvovirus 猪圆环病毒 2型 Porcine circovirus type 2 猪传 染性 胃肠炎 病毒 Porcine transmissible gastroenteritis virus 猪 水泡
11、 病病毒 Swine vesicular disease virus 猪 胸膜肺炎 放线杆菌 Actinobacillus pleuropeumoniae, 沙门氏 菌 Salmonella spp 猪链球 菌 2型 Streptococcus suis type 2 注： 必 须检测 ，普通 级可 以免 疫， 清洁 级和 无特 定病 原体级 不能免 疫； 必 须检测； 必 要时 检测 5.3 检测项目分类 5.3.1 必检项目 在进行实验用小型猪质量评价时 必 须 检测的项目 。 5.3.2 必要时检测项目 申请生产许 可证、从 国外引进 实验用小型猪和疑 有该 病原体感染 时必须增加 检测
12、的 项目。 6 检测程序 检测程序见图 1。 DB11/T 828.1 2011 4 *：结合 临床 症状 和实验 室检 查结果 ，需 要进一步 确证时 ，可 取特 定样 本进 行检测。 图1 检测程序 7 检测方法 检测方法见表 2。 表 2 实验用小型猪病原微生物检测方法 微生物 方法 口蹄 疫病毒 GB/T 18935； GB/T 22915 猪 瘟病毒 GB 16551；SN/T 1379.1 猪 繁殖与呼吸综 合征 病毒 GB/T 18090； NY/T 679 乙 型脑炎 病毒 GB/T 18638； GB/T 22333； SN/T 1445 伪狂犬 病病毒 GB/T 18641
13、 编号 外观检查 检测 结果判定 判定结论 采样* 耳后、背部毛发 或 皮 屑 采血 鼻拭子、肛拭子 （ 或 新鲜粪便） DB11/T 828.1 2011 5 表 2 实验用小型猪病原微生物检测方法（续） 微生物 方法 猪细 小病毒 SN/T 1919 猪圆环病毒 2型 GB/T 21674；附录 A 猪传 染性 胃肠炎 病毒 NY/T 548 猪 水泡 病病毒 GB/T 19200； GB/T 22917 布鲁氏 菌 GB/T 18646 皮肤 病原真菌 GB/T 14926.4 猪 痢疾 蛇样 螺旋 体 NY/T 545 支 气管 败血 波氏杆 菌 NY/T 546 多杀 巴氏杆 菌 N
14、Y/T 546；NY/T 564 肺炎 支原 体 GB/T 14926.8 猪 胸膜肺炎 放线杆 菌 NY/T 537 钩端螺旋 体 GB/T 14926.46 沙门氏 菌 NY/T 550 猪 链球 菌 2型 GB/T 19915.13； GB/T 19915.7 8 检测规则 8.1 检测频率 每 6个 月至少检测 一次。 8.2 抽样 8.2.1 方式 选择 6月龄以 上 的实验用小型猪用于检测 ， 随机抽 样。 8.2.2 数量 根据实验用小型猪群 体大小， 抽样数量 见表 3。 表3 抽样数量 群体 大小（ 头） 抽 样数 量 100 不少于 5头 100 500 不少于 10头 5
15、00 不少于 15头 8.2.3 方法 8.2.3.1 按病毒、细 菌、真菌、 寄生虫检测要求 联合采样 。 8.2.3.2 采样方法按照 NY/T 541进行。 8.3 样本要求 DB11/T 828.1 2011 6 样本要求有明 显标识 ，写明检 品名称、品 系 、 等级 、数 量及检测 项目等内容 ， 安全送达实验 室。 9 结果判定 9.1 抗体检查 免疫项目， 群体免疫 合格率70% ， 判为合格 。 非免疫项目 ，血清抗体 阴 性判为合格。 9.2 抗原和核酸检查 未见阳性结果判为合 格。 10 判定结论 所有项目 的检测结果均合 格，判为 符合相应 的等级 标 准 。 否则 ，
16、 判为 不符合相 应的等级 标准。DB11/T 828.1 2011 7 A 附 录 A （资料性附录） 猪圆环病毒 2型 ELISA抗体检测 A.1 原理 采用猪圆环病毒2型ORF2合成肽 抗原包被微 孔板 ，加入稀释的待 检血清， 经温育后， 若样品中含 有 特异性抗体 ， 则将与 微孔板上 抗原结合 ， 经洗涤 除去未 结合的抗体和其他 成分后， 加入酶标 二抗，与 微 孔 板 上 抗 原 抗体 复合物发 生特异性结合 ， 再 经 洗涤 除去未结合的酶标 二抗，在 孔中加入TMB 底 物 液 ，与 酶反应产生 蓝色产物 ，加入HF 溶液终止 反应后， 用酶 标仪630nm波 长测定各 反
17、应孔中 的OD值。 A.2 样品采集 A.2.1 样品类型 猪血清。 A.2.2 样品采集 无菌条 件下用一次 性 注 射器 取耳静脉 血 3mL5mL ，置于试管 中，分离血清，待 检。 A.3 操作步骤 A.3.1 用样品稀释液将待 检 样 品 40倍稀释后加 入 预包被 的抗 原板孔中，每孔 加100l。 阴、阳性 对照 各设2孔 ， 每孔100 l。 另设一空白 对 照 孔， 空白 对 照孔 加 100l 稀释液 。 轻轻振匀孔中样 品 （ 勿溢出） ， 置37温育30min。 A.3.2 甩掉板孔中的 溶液，用洗涤液洗板3 次，300l/ 孔， 每次静置3min后 倒掉，最后一次洗涤
18、 后在 干净吸水纸 上拍干。 A.3.3 每孔加酶标 二抗（抗猪 IgG-HRP结合物） 100l ，置37 温育30min 。 A.3.4 洗涤3次，方法 同 A.3.2。 A.3.5 每孔加底物A 液、B液 各50l， 混匀，室 温避光 显色10min。 A.3.6 每孔加终止液 50l， 10min内 测定结果。 A.4 结果判定 A.4.1 肉眼判定 “+”深度蓝色 ， 液 体不 透 明 ； “ +”蓝色， 液体微 透 明 ； “ +” 中度蓝色， 液体透光； “+”浅 蓝色，液体 透明； “” 无 色 ，液 体 完 全透 明 。以 显色“+”以 上判为阳 性。 A.4.2 酶标仪判定 A.4.2.1 以空白孔调零 ，在酶标仪 上测各孔OD630值。试 验成立 的 条 件 是 阳性 对 照 孔 平均 OD630值 0. 6，阴性对照 孔平均OD630值0.2。 DB11/T 828.1 2011 8 A.4.2.2 样品OD630值 0.42， 判为阳性； 样 品 OD630值在 0.38到0.42之间 ， 判为可 疑； 样品OD630值 0.38，判为 阴性。 _
