1、ICS 11.220 B 41 备案号：31304-2011 DB11 北京市地方 标准 DB11/T 819 2011 锦鲤疱疹病毒病诊断技术规范 Technical protocol for diagnosis of Koi Herpesvirus Disease 2011 - 08 - 09发布 2011 - 12 - 01实施 北京市质量技术监督局 发布DB11/T 8192011 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.12009 给出的规则起草。 本标准由北京市农业局提出。 本标准由北京市农业标准化技术委员会归口。 本标准由北京市农业局组织实施。 本标准起草单位：北京市水产技术推广站
2、。 本标准主要起草人：王姝、徐立蒲、张振国、王静波、曹欢、贾丽、殷守仁。 DB11/T 8192011 1 锦鲤疱疹病毒病诊断技术规范 1 范围 本标准规定了锦鲤疱疹病毒病（ KHVD）的样品要求、临床症状及流行病学特征、 PCR检测、结果判 定。 本标准适用于锦鲤疱疹病毒病的诊断。 2 规范性引用文件 下列文件对 于本文件 的应用是必不可少 的。 凡是注日期 的 引 用 文件，仅所注日期的 版本适用于本文 件。凡是不注日期的 引用文件，其最新版 本（包括所有 的 修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 2008 分析 实 验室 用水规格和试验方法 SC/T 7103 水生动物 产地检疫
3、采 样技术规 范 3 缩略语 下列缩略语 适用于本 文件。 KHV：锦鲤疱疹病毒（ Koi herpesvirus） KHVD：锦鲤疱疹病毒病（Koi herpesvirus disease ） PCR: 聚合酶链式反应 （Polymerase Chain Reaction ） DNA：脱氧核糖核酸（ Deoxyribonucleic acid） Taq酶：Taq DNA 聚合酶 （ Taq DNA polymerase） dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（Deoxyribonucleoside triphosphate ） 4 样品要求 4.1 水温 采集样品时 的水温应在 1632 。 4.2
4、 品种 采样品种为 锦鲤或鲤。 4.3 数量 按照SC/T 7103执行。 4.4 状态 DB11/T 8192011 2 采集的样品 不得腐败 。 4.5 信息采集 需采集鲤或 锦鲤发病 情况、混养其它鱼类发病情况 、采 样水温等信息。 5 锦鲤疱疹病毒病临床症状及流行病学特征 5.1 患 KHVD的锦鲤 和 鲤 ，具有下列 临床症状： 最显著 的特征为烂鳃, 鳃 出血并产 生大量黏液 ,鳃 丝溃烂； 体表出 现苍白的 块斑和水 泡；鳍条 和尾鳍充 血；鳞片上出现 血丝； 眼球凹陷； 口腔和 腹部充血和 出 血 。 5.2 患 KHVD的锦鲤 和 鲤 ，具有下列 流行病学特征： 混养池塘中,
5、只有 鲤或锦鲤（ 且 不 论 大 小 ） 生 病 和 死亡,而其它种类， 如金鱼 、草 鱼等无此现象； 水温在18 30时, 特别是在25 28时 , 鲤或锦鲤大量死亡 ,当 水 温升高或降低 时,死亡 现象下降或 停止； 死亡极快 ， 一条健康鱼从 出现临床症状到死只 有 24h48h；死亡率极高 ， 疾病发生 后 在 10天内, 死亡率可达80%100% 。 6 PCR检测方法 6.1 试剂和材料 6.1.1 水：符合 GB/T 66822008 中一级水的规 格 。 6.1.2 KHV阳性核酸 片断：由农业部指 定 机构 提供。 6.1.3 Taq酶：20 保存 ，不能反 复冻融或温 度
6、剧烈变 化。 6.1.4 dNTP：10 mmoL/L。 6.1.5 氯化镁溶液浓度：25mmoL/L。 6.1.6 扩增 KHV的 TK基因中 的 409bp片断的引物 ： 浓度 为 100pmoL/L 。其序列 如下： KHV-TK-F: 5-GGG-TTA-CCT-GTA-CGA-G-3； KHV-TK-R: 5-CAC-CCA-GTA-GAT-TAT-GC-3。 6.1.7 扩增 KHV的 Sph基因中 292bp片断的引物 ： 浓度 为 100pmoL/L。 其序列如 下： KHV-Sph-F： 5-GAC-ACC-ACA-TCT-GCA-AGG-AG-3； KHV-Sph-R： 5
7、-GAC-ACA-TGT-TAC-AAT-GCT-CGC-3。 6.1.8 DEPC水：用 焦碳酸二 乙酯（DEPC）处理过 的水。 6.2 器材和设备 6.2.1 普通冰箱和 超低温冰箱 。 6.2.2 组织研磨器 。 DB11/T 8192011 3 6.2.3 离心机和离心管。 6.2.4 PCR扩增仪。 6.2.5 水平电泳仪 。 6.2.6 微量移液器 及吸头。 6.2.7 紫外观察灯 或凝胶成像仪。 6.3 样品处理 6.3.1 体长小于 4cm的 鱼 苗取整条鱼， 体 长 4cm 6cm的鱼 苗取内脏（ 包括肾） ， 体长大 于 6cm的鱼 则 取肾、脾、 鳃；无临床症状的 鱼，
8、另外 需加取肠 和脑 组织。 6.3.2 将所取样品 匀浆成糊 状，按 1：10 的最 终稀释度 悬于 磷酸盐缓冲 液（参见附录 A.1）。 6.3.3 将 450L 悬 液放入 1.5mL的离心管，再加入 450LCTAB 溶液（参见附录 A.2）并混 匀，25 作用 2小时 。 6.4 DNA抽提 在含有样品的离心管中加入 600L抽提 液（参见附录 A.3），用力 混合。12000r/min离心 5min， 取上层水相 （ 约800L ）。再加入 700L抽 提液 （ 参见附录A.4 ） ， 用力混合 。 12000r/min离心 5min， 取上层水相（约 600L）。 再加入预冷 的
9、 1.5倍 体积 的无水乙醇（约 900L） ，倒置数次 混匀后，放置 离心管于20下，至少8h 后取出。12000r/min 离心 30min，倒去上 清液。将离心管倒置 于吸水纸上 ， 吸干液体。 加11L DEPC水溶 解后，作 为PCR模板 。 6.5 DNA扩增 6.5.1 使用 KHV-TK引物的反应 体 系为 100L ：在 0.2mL反应 管 中 加入 10 L模板 、 2.5L dNTP 、 10L 氯化 镁溶液、10 L 10倍 Taq酶 缓冲液 （参见附录 A.5）、 KHV-TK-R和 KHV-TK-F 各 1L、2.5U Taq酶、加 DEPC水至 100L。 将反应
10、管置 于 PCR扩增 仪 。 反应 程序：94 变性 5min；95 变性 1min、 50退火 1min、 72 延伸 1min，40 次 循环；72 延伸 10min；4 保温。 6.5.2 使用 KHV-Sph引物的 反应体系 为 100L ：在 0.2mL反应 管 中 加入 10 L模板 、 2 L dNTP、8 L氯化镁溶液 、10L 10 倍 Taq酶 缓冲液、 KHV-Sph-R和 KHV-Sph-F各 0.5 L、 2.5U Taq酶、 加 DEPC 水至 100L 。 将反应 管置于 PCR扩增仪 。 反应程 序： 94 变性 30s； 94变性 30s、 63 退火 30s
11、、 72 延伸 30s，40 次 循环 ；72延伸 7min； 4保温 。 6.6 设立对照 6.6.1 在 6.3样品 处理过程 中应设立 阳性样品 对照、阴 性样品 对 照、空 白对照。 6.6.2 取 KHV阳性 核酸片断 作为阳性 对照。 6.6.3 取正常的鱼 组织抽提 核酸作为 阴性对照。 6.6.4 取等体积的水 代替模板作为空 白对照。 6.7 琼脂糖电泳 用TBE电泳缓冲 液（参见附录 A.6）， 配制1.5%的 琼脂 糖平板（含1L/mL EB， 参见附录A.7 ）。将 平板放入水平电泳槽，使电泳缓冲液 刚好淹没 胶面。 将6L样品和2 L上样缓冲 液（参见附录A.8） ，
12、 按比例混匀 后加入样品 孔 。 在电泳时使 用核酸分 子量 标准参考物 作对照。 5V/cm电泳约 0.5h,当溴酚蓝 到 达底部时停止 。 DB11/T 8192011 4 7 结果判定 7.1 PCR检测结果的判读即 在 紫外 光下观察 扩增带。用 KHV-TK 基因引物， PCR后阳性 对 照会出 现一条 409bp的 DNA片段； 用 KHV-Sph基因引物，PCR 后阳性 对 照会出 现一条 292bp的 DNA片 段 。阴 性 和 空白 对 照 无上述 核酸带。 7.2 如果被检测样品有临床症状，PCR 后能 够得到 409bp和/或 292bpDNA片段者 ， 则 可确 诊 为
13、 KHVD。 7.3 无临床症状样品，PCR 后能够 得到 409bp和 /或 292bpDNA片段者， 则判定样品为 KHV可 疑 。可 疑 的样品可经 基因测序 确定是 KHV后 ， 判定 为 KHV阳性 。 7.4 PCR后没有得 到 409bp和 292bpDNA片段者 ， 判定 为 KHV阴性。 DB11/T 8192011 5 附 录 A （资料性附 录） 试剂配制 A.1 磷酸盐缓冲液 称 取 氯 化 钠 （ NaCl） 7.9g， 氯化 钾 （KCl） 0.2g，磷酸二 氢钾 （KH 2PO4） 0.24g，磷酸氢 二钠 （Na 2HPO4） 1.8g，溶于800mL蒸馏 水中
14、，调节 溶液酸 碱度至7.4，最 后 加 蒸馏 水定容至1L 。 A.2 CTAB溶液 按CTAB（hexadecyl trimethy ammonium bromide）2% ， 氯 化 钠 （ NaCl）1.4moL/L ，乙二胺四 乙酸 （EDTA）20mmoL/L，三羟 基氨基甲烷 盐酸（Tris-HCl ）20mmoL/L配制 ， 调节溶液 酸 碱 度 至 7.5，用前 加 巯基乙醇至终 浓度为0.25%。 A.3 抽提液 1 mmoL/L 三 羟基氨基 甲烷饱和 酚（Tris- 饱 和 酚）、 三氯甲烷（CHCl 3）、异戊 醇（C 5H12O）按 25： 24：1的比例 混合，密
15、闭避光保存 。 A.4 抽提液 三氯甲烷（CHCl 3）、异戊 醇（C 5H12O）按 24：1的 比例 混合，密闭避光保存 。 A.5 10倍Taq酶缓冲液 按三羟基氨 基甲烷盐 酸 （Tris-HCl，酸 碱 度 8.8） 500mmoL/L， 氯化 钾 （KCl） 500mmoL/L，聚 乙 二 醇 辛 基 苯 基 醚 （ Triton X-100）1% 配制。 A.6 TBE电泳缓冲液（5 倍浓 缩 ） 称 取 三 羟 基氨 基 甲烷 （Tris ） 54g， 硼 酸 （HBO 3） 27.5g， 乙二胺四 乙 酸 （ EDTA） 2.9g， 加 水至1000mL ， 用 稀盐酸（HCl）调节 酸碱度到 8.0。 A.7 EB （Ethidium Bromide，核酸染色剂） 用水配制 成 10mg/L的浓缩液 。用时每 10mL电泳 液或 琼脂中加 1L。 A.8 6上样缓冲液 溴酚蓝100mg， 加双蒸水5mL，在室温下 过 夜 ， 待溶 解后 再 称 取 蔗 糖 25g，加双蒸 水溶解后移入 溴酚 蓝溶液中， 摇匀后定 容至50mL ，加入氢 氧化钠1 滴， 调至蓝色。 _
