1、省DB13方标准DB13/IS55-2004猪弓形虫病防治技术规程2004-07-05发布2004-07-05实施河北省质量技术监督局发布DB 13/i555-2004前言本标准附录A、附录B为规范性附录。本标准由河北省畜牧局提出。本标准起草单位:河北省畜牧兽医研究所。本标准主要起草人:秦建华、张继东、赵月兰、李淑芳、杨淑亚。DH 13/C555-2004猪弓形虫病防治技术规程1范围本标准规定了猪弓形虫病的诊断和防治。本标准适用于生猪饲养场(户)及动物诊疗单位对猪弓形虫病的诊断和防治.2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(
2、不包括勘误的内容)成修订版本均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB 16548畜禽病害肉尸及其产品无害化处理规程NY/T 573弓形血病诊断技术NY 5030无公害食品生猪饲养兽药使用准则NY 5032无公害食品生猪饲养饲料使用准则NY 5033无公害食品生猪饲养管理准则3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3. 1弓形虫病由龚第弓形虫引起的一种人和多种动物共患寄生虫病.猪弓形虫病的主要特征为稽留高热，呼吸困难，皮肤发给，流产，便秘或腹泻.临床可见急性、亚急性和慢性三种病型.可引起大批死亡.是
3、目前危害养猪业的一种主要的寄生虫病。3. 2滋养体又称速殖子，呈香蕉形或半月形，一端较尖。一端钝圆.一边较扁平.一边较弯曲。大小为(4-7)“mX (2-4) u m.用姬姆萨染色后可看到胞浆呈浅蓝色，有颗粒.核呈深蓝紫色.偏于钝圆一端.用苏木素染色时可见到核膜和核仁。滋养体主要发现于急性病例，在腹腔渗出液及血流中.单个或成对排列，在有核细胞内(单核细胞、内皮细胞、淋巴细胞等).还可见到正在繁殖的虫体.形状多样.有圆形、卵圆形和正在出芽的不规则形状等，有时在宿主细胞的胞浆里，许多滋养体簇集在一个囊内称之为假囊。3. 3包班又称组织囊.呈圆形或椭圆形.外面有一层富有弹性的囊壁，囊内有数个至数千个
4、缓殖子，故包囊直径大小差别很大.小的仅50 u m，大的可达100 u m.缓殖子的形态与速殖子相似，仅核的位置稍偏后。包囊多见于脑、眼、骨骼肌、心肌和其它组织内，是虫体在宿主体内的休眠阶段，见于慢性病例。3. 4裂殖体在终宿主猫的肠绒毛上皮细胞内，早期可见其含有多个细胞核，成熟时则含香蕉形的裂殖子.前端较尖.大小为4.9umX1.5um，其数目不定，约4-29个，但以10-15个居多，呈扇形排列.3. 5配子体在猫肠细胞内进行的有性繁殖期虫体.有雄配子体和雌配子体.雄配子体呈圆球形，直径约l0um.DH 13/f555-2004用姬姆萨染色后，核呈淡红色而疏松。细胞质呈淡蓝色。发育成熟的雄配
5、子体可形成1232个雄配子，新月形.长约3pma雌配子体呈圆形，成熟后称雌配子.在生长过程中形态变化不大.仅体积增大.可达I S u m -20 u m。染色后可见核深红色，较小而致密.细胞质充满深蓝色颗粒。3.B卵班出现于猫肠道中.随粪便排到外界。呈卵圆形，有双层囊壁，表面光滑，大小为(I1一14) u mX(9-11) u m，平均12umXl0umo抱子化卵囊内含有两个卵圆形的抱子囊.其大小约为BumX6um.每个抱子囊内含有4个长形弯曲的子抱子，大小约SNmX2um，有残体。4诊断4. 1诊断原则逝过流行病学调查、临床诊断、病理诊断等作出的诊断可作为处理疫情的依据.确诊须经实验室检查分
6、离到病原或检测到特异性抗原或抗体。4.2流行病学调查a)周围地区有类似病例发生:b)场内新引入猪只呈现类似症状;c)饲喂同批饲料或饮川同一水训的猪同时发病:d)发病猪没有明显年龄差异;e)发病没有严格的季节性，但秋冬季和早养发病率最高.4.3临床诊断4. 3. 1急性型猪急性型弓形虫病的主要症状有:a)急性型的潜伏IVl为7d-7d。体温升高到40.5 0C 42C ,呈稽留热型;b)病猪精神沉郁.食欲废绝或减退.呼吸困难.呈明显的腹式呼吸.i犬坐式姿势.流浆液性弊液;c)皮肤发纷。在嘴部、耳部、卜腹部及一F肢皮肤出现红紫色的斑块或间有小出血点;d)仔猪感染后，临床上常见!L y9 r尿少，呈
7、黄褐色.病程2d-6d常发生死亡:e)怀孕母猪感染后。流产或新生仔猪出现先天性弓形虫病而死亡。4.3.2亚急性型潜伏期为IOd-14d.较急性型的症状缓和。4.3.3慢性型病程较长。病猪表现为厌食.逐渐消瘦.贫血.随着病程的发展，病猪可出现后肢麻痹，并导致死亡.但多数病猪可耐过。4. 4病理诊断4. 4. 1急性型和亚急性型急性型和亚急性型的病理变化主要有:n)全身淋巴结髓样肿胀并有坏死点;b)肠枯膜潮红、糜烂、肥厚.并有出血点、出血斑.有的病例在盲肠和结肠有少数散在的豆大溃疡灶;c)胶腔内有多徽渗出液;d)脾脏I11大或萎缩，脾髓泥状，滤泡、脾小梁不清。常可见少量粟粒大丘状出血点及灰白色小坏
8、死kf:;e)肾脏呈黄褐色，常见针尖大的出血点和坏死灶;f)肺间质水肿、胸腔积液.心脏肿大.肝脏有坏死点:g)网状内皮细胞坏死。滋养体位于有核细胞内或细胞外。DH 13/i555-20044. 4. 2怪性型各内脏器官水肿，并有散在的坏死灶.病理组织学变化为明显的网状内皮细胞增生，淋巴结、肾、肝和中枢神经等处更为显著。但不易见到虫体。4.4.3隐性感染在中枢神经系统内见有包遨，有时可见有神经胶质增生性脑炎和肉芽肿性脑炎.4. 5病原学诊断4. 5. 1病料的采集采集肺、肝、淋巴结、脾、心血及胸腹水等作为特检病料。4.5.2涂片染色检测待检病料作涂片.干操、固定.用姬姆萨氏或瑞氏液染色.镜检有无
9、滋养体。4.5.3集虫法检查取肺脏及肺门淋巴结研碎加10倍生理盐水滤过.500r/min离心3min，取上清液再1500r/min离心lOmin.取沉渣涂片染色镜检。4. 5. 4动物接种试验将肺门淋巴结、肺、脾等组织研碎，加入10倍量生理盐水，在室温下放置1h，取其上清液O.SmL-ImL接种于小鼠腹腔.如小鼠有症状出现，检查腹腔液，存在虫体即证明发生弓形虫病;如无症状出现，并检查腹腔液中无虫体，可盲传3代后进行检测，有虫体者即为本病.4. 5. 5病原体形态学观察弓形虫在全部生活史中可出现数种不同的形态.可查出滋养体或包囊、裂殖体、配子体、卵囊。4. 6免疫学检测4.日.1染色试验可通过染
10、色试验的方法用于猪弓形虫的早期诊断，具体方法按附录A的规定执行。4.6.2间接血凝试验u7通过间接血凝试验方法检测猪是否撼染弓形虫.具体方法按NY/T 573和附录H的规定执行.5防治5.1预防5.1.1推荐实行小单元式饲养，实施全进全出制饲养工艺.养猪场内严禁饲养禽、犬、猫及其他动物.避免猫及鼠粪便污染饲料及饮水。5.1.2流产胎儿及其它排泄物.包括流产场地均需进行严格消毒处理。5.1.3对死于本病的和可疑的动物尸体严格处理，处理方法按照GH 16548的规定执行。5. 2治疗5. 2. 1在发病初期及时用药.可根据病情选择磺胺类或林可霉素类药物进行治疗。5. 2. 2药物的选择应符合NY
11、5030的规定，严格掌握选用药物的剂量、应用时间和休药期。5. 2. 3允许使用国家兽药管理部门批准的针对本病的中草药制剂。5.2.4建立并保存治疗记录.并应在清群后继续保存2年.DH13/C555-2004附录A(规范性附录)弓形虫染色试验A.1方法提要染色试验是弓形虫病所特有的免疫血清反应诊断方法。其原理是弓形虫在与阴性血清作用后仍能被碱性美蓝染液所深染。但与阳性血清(抗体)作用后则不着色或着色很淡.这种抗体称为胞浆改变抗体，其在辅助因子参与下，可使弓形虫胞浆中本来可以被着色的成份消失。据此便可判断被检者血清中是否含有弓形虫抗体。该法的优点是待异性强，感染后数天即可出现这种抗体，可用于早期
12、诊断。但本法所用抗原为活虫，欠安全:辅助因子的获得较困难，是其不足.A. 2试剂e)美蓝、硼砂( l OFI,O ),碳酸钠(分析纯):b)生理盐水、95%乙醇、蒸馏水(iD1).形虫阳性对照血清。.3设备和仪器a)恒温培养箱，h)离心机;c)水浴锅;d)光学显微镜:e)分析天平:f)移液. ,g) lOUmL磨q锥1L瓶:h) 1000iiil.容嫩瓶.A. 4操作步骤A. 4. 1材料准备.4. 1.，喊性美蓝溶液a)称取碳酸钠5. 3g放入1000mL容量瓶中，加蒸馏水完全溶解后定容，即成0. 53%碳酸钠溶液.b)称取.砂(lOH=O) 3.62g放入1000mL容量瓶中，加燕馏水完全
13、溶解后定容.即成1.91 %lll砂溶液。c)取0. 53%碳酸钠溶液97. 3mL和1. 91%TV19砂液2. 7mL放入100mL磨口锥形瓶中.摇匀.即成pf! 11的缓冲下应.d)称取美监14. 6g放入1000mL容ai)Ili中。加95%乙醉完全济解后定容.即成美蓝饱和溶液。e) iit;取关蓝饱和Tfi7ti lOmL和liu1的缓冲液9GmL放入100mL磨口锥形瓶中，摇匀.即成碱性美蓝溶液。A.4.1.2抗原制备采取人_I :!#染弓形虫72h后的小自鼠腹水，加生理盐水洗涤，以3000r/min离心lOmin,重复操作2-3次后，用生理盐水混悬稀释至4C0-600倍，镜检，侮
14、个视野含虫体30-40个，即甸mL混悬液含弓形虫约50U万个A.4.1.3辅助因子即健康人血清。夕仁非f.个健康人的血清都含有这种辅助因子，须预先经过测试.大约f个人中有一个人可用。测试方法是取按A. 4. 1. 2方法制备的抗原C. 12mL.加待测健康人血消e. cHa.,混合后j“- 3?水浴中作l+J 1h,冷却.加入碱性美蓝溶液O. 1mL. ftti匀，静n lOmin,吸出镜检100个游离虫休。若NIA:个以上虫体着色时则该血清可用。A.4.1.3被检血浩DB13lf555-2004采血分离的待检生猪血清，用前置3:水浴中30min灭活。A. 4. 2将被检血消用生理盐水作倍比稀
15、释至1:256.然后取0. 1mL分别置试管内，各加辅助因子0. 2mL再加抗原0. 1mL.A. 4.，置3TC温箱中12h.取出特冷:加美蓝染液24滴.振荡5min-6min后.分别镜检计数各管内100个游离虫体的着色与未着色的比例判定结果。A. 4. 4另设阳性对照和阴性对照管.前者以阳性血清代替被检血清井同样稀释.后者以生理盐水代替被检血消。A. 5判定标准在阳性对服虫体全部不着色、阴性对照90%以上虫体着色的倩况下.对被检血清管进行判定:a)未着色虫体在60%上为PCi性:b)未着色虫体在40%-59为可疑:c)未着色虫体在3I:%以下为阴性。对猪弓形虫病.当1:16-1:32稀释时
16、，呈阳性时为可疑.1:64稀释时，呈阳性时判该猪为已受感染。DH 13/1555-2004附录B(规范性附录)弓形虫病间接血凝试验日.1方法提要间接血凝试验是诊断弓形虫病所特有的免疫诊断方法.其原理是利用结合在红细胞上的弓形虫抗原在与血清中的抗体反应后，出现肉眼可见的凝集现象。据此便可判断被检者血清中是否含有弓形虫抗体。该法的优点是待异性强，感染后数大即可出现这种抗体，可用于早期诊断.B. 2试剂a)弓形虫间接血凝试验冻干抗原、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠、迭氮钠(分析纯):b)弓形虫标准阳性血清(效价不低于1:1024)、弓形虫标准阴性血清、健康兔血清、燕馏水(蒸)。B. 3设备和仪器a)
17、恒温培养箱;b)离心机;c)微型振荡器:d)分析犬平;e)移液器;f) 96孔V型微量血凝反应板;目100mL磨口锥形瓶:h) 1000mL容量瓶。B. 4操作步骤B. 4. 1材料准备B.4.1.1稀释液a)称取氛化钠9. 25g,磷酸二氢钾2.B6g. I酸氢二纳(无水)19.34g、迭氮钠1.008放入1000mL容量瓶中，加燕馏水完全溶解后定容。过滤分装，10磅ISmin高拣灭菌，即成0.1 %迭氮钠的0.15mo1!L磷酸盐缓冲液(PBS)ob)取上述溶液98mL和健康兔血洁2mL放入100mL磨口锥形瓶中，ii.无菌分装。00C-vA0C保存条用。8.4.1.2诊断液将5形虫间接血
18、凝试验冻干抗原.按标定毫升数用灭菌蒸馏水稀释摇匀.1500r,/min-2000r/min离心5minlOmin.弃去上消液.加等最稀释液摇匀，置4左右，24h后使川.0C -4左右保存lOd内效价不变。日.4.1.3被检血清无菌采取待检猪血液并分离血清.检验前56灭能30minoJ呼.2在96孔V型微最血凝反应板上。用移液器侮孔加稀释液。.075mL。定性检查时，侮个样品加4孔;定量检查时，爆个样品加8孔.短块板上不论检儿个样品.均应设阳性血清对照和阴性血清对照组，对照组均加8孔。B.4.3加入样品血清、阳性对照血清和阴性对照血消.第1孔加相应血清0.025mL,B.4.4定性检查时稀释至第
19、3孔.定员检查时稀释至第7孔.定性的第4孔、定觅的第8孔为稀释液对照;按常规用移液器稀释后，取0. 025mL移入相应的第二孔内，如法依次往F稀释，至应稀释的最后一孔.稀释后弃去0. 025mL,梅个孔内的液体仍为0. 075mL.各孔的稀释度分别如表Ti. 1所示。B.4.5将诊断液摇匀，每孔加0. 025mL。加完后将微员血凝反应板置微型振荡器上振荡lmi.n2min,DH 13/f552004直至诊断液中的血球分布均匀.取下反应板，盖上玻璃板.以防落入灰尘，里22C -37下2h-3h后观察结果。裹:1各组各孔的希释度孔号12345678被检血清定性1:41:161:64稀释液定量1:4
20、卜T1:641:2561:10241:40961:16384稀释液阴性对照卜41:161:641:256卜10241:40961:16384稀释液阳性对照卜4卜Z;1:641:256卜IY!1:40961:16384稀释液B.5结果到定B. 5. 1到定标准a)(+):SQL%红细胞在孔底呈均质的膜样凝集，边缘整齐、致密。因重力关系.膜样毅集的红细胞有的出现下滑现象。b)(+十):IN“%的红细胞在孔底呈膜样凝集.不凝集的红细胞在孔底中央集中成很小的圆点。c)(+):4Y;%的红细胞在孔底呈稀疏的凝集.不凝集红细胞在孔底中央集中成较大圆点。d)(十):?%的红细胞在孔底凝集，其余不凝集的红细胞在孔底中央集中成大的圆点.e)(一):所有的红细胞均不凝集。并集中于孔底中央呈规则的最大的圆点.B.5.2到定方法在阳性对照血消滴度不低于1:1024(第5孔).阴性对照血清除第1孔允许存在前滞现象(十)外.其余各孔均为(一)，稀释液对照为(一)的前提下，对被检血清进行判定。以被检血清抗体滴度达到或超过1:64判为阳性，判(+)为阳性终点。
