1、省DB方标准DB 13/T553-2004波尔山羊胚胎移植技术规程2004-07-OS发布2004-07-OS实施河北省质量技术监督局发布DH 13/I553-2004前言本标准附录A和附录B为规范性附录.本标准由河北省畜牧局提山。本标准起草单位:河北科技师范学院。本标准主要起草人:李佩国、冯敏山、张香斋、李索芬、李组玉、李雪竹、孙铁路、赵宝华、姜中伸DB 13!1553-2004波尔山羊胚胎移植技术规程1适用范围本标准规定了波尔山羊胚胎生产中供体羊的选择、超数排卵及配种、手术冲卵技术、胚胎质量鉴定、受体羊的选择和胚胎手术移植技术.本标准适用于波尔山羊的胚胎生产和移植.2供体羊的选择2. 1供
2、体羊应符合波尔山羊的品种特征，谱系清楚，遗传性稳定.生产性能良好.2. 2供体羊健康状况良好，体质健壮.无通传性和传染性疾病。繁殖机能正常.既往繁殖力高.2. 3有1胎以上的繁殖史，年龄在2-5岁，产后3个月的空怀母羊.3供体羊的超致排卵及配种3. 1超致排卵3.1.1超数排卵的季节和发情周期波尔山羊最适超数排卵季节为当年9月下旬至11月下旬和次年的2月下旬至3月下旬。波尔山羊的发情周7l在18d21d,3.1.2激素选择和剂最根据供体羊个体情况，选择适宜的激素和剂量.一般采用:e)促卵泡素(FSH)，肌注100IU/只一150IU/只:b)促黄体生成素(Lli)。根据FS11的注射剂量，肌注
3、100IU/只一120IU/只，c)氯前列烯醉(ICl)，肌注0. 08m以次，每天注射两次.3.1.3超数排卵方法3.1.3.1以母羊发情之日作为发情周期的Od，在母羊发情周期的第15d开始.每天6:00-7:00和18:00-19:00各注射1次FSH,连续3d，递减注射.3.1.3.2在第5, 6次注射FSH时，同时肌肉注射ICle3.1.3.3确定供体羊发情后立即注射LH，如果i未注射完供体羊己发情，停止注射FSH，立即注射LH.3.1.4供体羊发悄鉴定3.1.4.1时间在第s次注射rsii时即对超排供体羊观察发情。3. 1. 4. 2方法试情公羊扎好试情布，放入母羊群中试情，傅30-
4、40只供体羊需1只健康试情公羊，当母羊接受公羊爬跨，站立不动，或母羊围着公羊旋转，并不断摆尾，作为发情的标准.3. 2配种3. 2. 1种公羊的选择种公羊应符合波尔山羊的品种特征，谱系清楚，遗传性稳定.生产性能优良;健康状况良好，体质健壮.无遗传和传染性疾病;繁殖机能正常.3. 2. 2本交从供体羊接受爬跨进行第一次交配，侮8h-r 12h配种1次，直至发情结束。DH 13/T553-20043. 2. 3人工授精3. 2. 3. 1操作要求a)采精、抽液稀释、输精用的器械严格灭菌、消毒。6)采栩前对种公羊外生殖器清洗消毒。c)稀释后的精液rn度要保持在25 0C-300C的环境中。d)输精前
5、.母羊州男部必须经过清洗消毒。e)输入的鲜精活力在0. 6以上，侮次输精有效精子数不少于3X10.输粉次数不少于2次.f)选择适宜的输稍部位。3. 2. 3. 2时间确认发情时立即进行第一次输精.之后侮间隔8h-12h输精1次。直至发情结束.4手术冲卵技术4.1主要器材a)手术台:b)剃须刀;c)创布;d)止血纱布:。)7毛17;f)手术刀柄;B)手术剪;h) .if.-血钳;)p帕钳;)持针器:k)肠41t(带乳胶管);I)手术刀片:m)缝合线，n)缝合针:o)摄子;P)中120mm表面皿;。) 1dOmm表面皿;r) 6#-d#头皮针(尖端磨钝);s) 18#-2D#头皮针(尖端磨钝);t
6、) 10二透明硅胶管:u) lOmL注射器;v) 20mL注习寸器;w)中8mm玻璃管:x) 35mm培养皿.Y)体视显微镜.4. 2药品a) 7b96酒精、5%碘配、新洁尔灭、生理盐水、液体石蜡、双蒸水，b)青霖索、链霖素、牛血消白蛋白、氯化钠(NaCI)、磷酸二氢钾( KH,POa )、磷酸氢二钠( NalIPO, )、氯化钾(KCl).4. 3试液的配制DH 13/T553-20044. 3. 1砚酸缓冲盐水(PBS)称取NaCl 8. 0g. KHPPO, 0. 2g, Na,HPO, 2. 13g. RCl 0. 2g，加双蒸水1000mL，完全溶解后加适量的3M NaOH调pH为7
7、. 4.即为PBS液.4.3.2冲卵液量取配置好的ice.液1000mL.加入牛血消白蛋白4g.充分摇匀即成.4. 4冲卵步骤4. 4. 1手术4.4.1.1术前准备手术前24h停止饲喂草料，限量饮水，手术器械在使用前用0. 5%新洁尔灭液浸泡0. 5h:严格按外科手术要求进行自身消毒.术者分工要明确。4.4.1.2保定与麻醉将母羊仰卧保定，麻醉。4.4.1.3手术部位在离乳房前端约2cm处，腹中线的两侧均可。4.4.1.4术部剪毛剪毛范围约20cm X 20cm。用肥皂水消洗手术部位.同时剃净毛茬，再用清水洗净。4.4.1.5术部消毒手术部位按外科手术要求常规消毒，盖上术巾.4. 4. 1.
8、 B避开血管，用手术刀于术部纵向切开6cm-8cm长的刀口.将皮下结缔组织分离.暴露肌膜。用手术刀将肌膜轻轻切开，暴露肌肉层.再用刀柄后端将肌肉层钝性剥离，剪开腹膜。在骨盆腔。膀肤周围触摸了宫角并轻轻地将子宫角引出切口外.4. 4. 2输卵管冲胚4. 4. 2. 1冲胚时间在超排母羊发情后66h-72h从输卵管采集2-8细胞胚胎，进行鲜胚移植。4.4.2.2方法用6#-8#头皮针从子宫输卵管接合部的子宫端导入到输卵管峡部，将喇叭口导卵管从输卵管喇叭口插入3cm-4cm，导卵管远端与巾120mm表面皿相接.助手事先用lOmL注射器抽取5mL-8mL冲卵液.与头皮针相接.把冲卵液缓缓推入输卵管，胚
9、胎即随同冲卵液自输卵管回收到表面皿中，另一侧输卵管冲胚操作方法同上.4. 4. 3子宫冲胚4. 4. 3. 1冲胚时间在超排母羊发情后6V-7de4.4.3.2方法用套有胶管的肠钳夹在子宫角分叉处，从宫管接合部约。. 5cm处避开血管向子宫角方向插入6#-8#头皮针，当确认针头在宫腔内进退畅通时.用硅胶管连于注射器上。把冲卵液缓缓注入子宫腔。待子宫角膨胀时，用子宫导卵管从子宫角基部导入子宫腔，导卵管的另一端接一 180mm的表面皿.同时轻轻挤压子宫角前端，将冲卵液导出，傅侧子宫角需要50mL60mL冲卵液，另一侧子宫角操作方法同上。4.4.4术后处理4. 4. 4. 1冲胚完毕后.用25C-3
10、00C的生理盐水将内脏冲洗干净:将25C -30的灭菌液体石蜡5m1-lOml注入11腔，以防粘连.4. 4. 4. 2供体母羊创口采用三层缝合法。即腹膜、肌肉连续缝合;皮肤结节缝合.针脚间距lcm.在肌肉与皮肤问撒适量青、链霉素粉，以防创口感染。4. 4. 4. 3术后3d-5d注射青霉素和链恶素，每天2次.DB 13!C553-20045胚胎质最鉴定5. 1检胚5.1.1方法将收集的冲胚液。在放大l OC-200倍的体视显微镜下检胚.将检出的胚胎放入盛有保存液的巾3omm培养皿中。5.1.2胚胎类型超排母Gfiii F66h-72h11 li01 rf,“ti,pIIT法采2fNl.t.
11、41胞、8$U胞及少数16Ni9LIfN。上述发育期按国际胚ii i Xy植协会规定的数码均表示为20超排母羊发情后Ed-7d用子宫冲胚法采集胚胎，将胚胎分为桑棋胚iM?、致密桑棋胚(C1)、,;.期囊1 (C13)、囊胚(fl )._L述发育期按国际胚胎移植协会规定的数码分i:1丧示为出组、5、6。J. 2胚胎的质4ls鉴定5. 2. 1胚胎发育特征5. 2. . . 1桑根胚(M)能观察:;球状细胞团，分不错分裂球，形似桑棋. iii据透明带内腔的大部分。5.2.1.2致密最棍胚(CFd)细lk!1变小二.f n明带内腔的60-7UN,5.T1.3早期囊胚(EB)细胞的一部分出现发亮的胚泡
12、胶 . .i.u纹状.发暗的内细胞团和亮而透明并包围囊腔的滋养层细胞。细腿i:J,!:i透明带内“r,=的70%ao.难以分消内细胞团利滋养层。s. 2, i . a轰胚(日)内 i准 ! i1f0i 滋养层界I-fi晰;钊父集于一极。囊胚进一步扩大.胚泡腔明显，细胞充满透明带内li,5、2.2胚胎分级5, 2. 2. !处7发有期2细胞的胚胎:卵裂球轮廓清楚，球体饱满，透明度适中.数日吻合即可定为1级:1 /3 (“l x1球死亡1 .-.1a2级:1/2卵裂球死亡可定为:1级;其余定为4级。1级、L级、3级胚胎均可1FJ于鲜胚移植。5. 2. 2. 2桑猫巡至逝胚阶段:!困冶一般分为1级、
13、2级、3级、4级，其中1, 2和3级为可用月到台.4级胚):ii无利IJ价iii.5. 2. 2. 2. 1 1级则价:胚胎发育阶段与胚龄一致。)困冶形态完整.轮廓清晰呈球形。分裂球大小均匀，H细胞结构紧凑适i)i1:好，无附着细胞和泡液.5.2.2.2.2级杯胎:1困价发育阶段和胚龄其本一致。胚胎轮廓清晰.色调和细胞密度良好.可见一些附粉细胞和泡液，变形细Jli:约i!i lOYa-JOti,5.2.2.2.? .iJiiti!Fi: IIIIii1i1?f=ili.cttii不太一致。lull轮廓不清晰，色uS11 .结构较; t,游?iailJ1L II CK较多，变性-i4胞i i :
14、lL -504. 05. 2. ? 2. 4 =1级!困冶:未受档卵、16细胞以-F的受精卵、有碎片的退化卵、细胞变性等均属9级，不能作为IiT移li“胎利川。5.3记录按照附录A卜的要求填写所有内容.B受休羊的选择选择繁范机能正常，无传染性疾病、健康、膘情适中，年龄在1. 5-6岁之flJ的经产母羊。受体羊统一打号、建档、I独y川l,专人5理二7胚胎手术移植技术DH 13/C553-20047. 1受体羊的同期化发情处理7.1.1方法7.1.1.1药品:氯前列烯醇。7.1.1.2剂量:0. 07mg/只，次。7.1.1.3方法:与供体羊同时进行第一次注射:第二次注射在第一次注射后lOd.第二
15、次注射后12h-48h观察发情7.1.2供体羊、受体羊同期化发悄判定T.1.2.1供体羊、受体羊均采用试倩公羊确认发情.7.1.2.2把供体羊发情之日定为11，与供体羊同时发情的受体羊定为Oh受体。比供体羊提前12h发情的定为-12h受体.提前24h的定为-24h受体。比供体羊推迟12h发情的受体定为一12h受体，推迟24h的定为一24h受体。7.1.2.3胚移植时Oh受体，1 12h受体移植效果无显著差异。如果受体缺乏，可使用124h受体.超过124h的受体不再使用。7. 2胚胎移植技术7. 2. 1受体移植所需器械.)立体显微镜:b)手术台;e)剃须刀;d)剪毛剪;e)手术刀柄;f) It
16、血钳:e)巾帕钳;h)持针器;i)手术刀片。)缝合针:k)缝合线;I)创布;m)止血纱布;n) 16#针头(尖端磨钝);o) 35mm培养皿;P)一卜介苗注射器:Q)针头式细菌掩器;r) 5mL-次性注射器:7. 2. 2受体移植所需药品75%酒精、碘配、新洁尔灭、生理盐水、液体石蜡、青霉素、链霉素.7.2.3受体移植操作步日7.2.3.1移植器的制作a)将卡介苗注射器洗净，烘干。b)拨出注射器内芯。将注射器管的前端在酒精灯上灼烧，拉制成长5cm-6cm，直径lmm-1.2mm的细管.冷却后用砂片将尖端断齐，再将芯插入管内。注意管与芯是配套的不能搞棍。e)将断齐的口端在酒精灯上小心烧结.使其圆
17、滑，但不能变形，即制成移植器。7. 2. 3. 2受体母羊的手术法移植技术7. 2. 3. 2. 1手犬过积同4_4.1DH 13/f553-20047.2.3.2.2胚胎的移植部位:与供体母羊冲胚部位一致。输卵管胚在输卵管移植。子宫胚在子宫移植.7.2.3.3吸取胚胎用移植器先吸一段lcm长的保存液.再吸一段0. 5cm的空气.然后吸取胚胎.含胚胎的液柱不超过1. 5cma7. 2. 3. 4输卵管移植将具有黄体一侧的输卵管伞部拨开.找到管口.把装有胚胎的移植器从此插入3二一4cm然后将胚胎轻轻推入输卵管即可.7, 2. 3. 5子宫移植将具有黄体一侧的子宫角取出。用尖端磨钝的16#针头在子
18、宫壁上扎一孔，把装有胚胎的移植器从此孔插入子宫腔内。仲至子宫角尖端后将胚胎轻轻推出即可.7. 2. 3. 6术后处理操作步骤同4.4.4e7. 2. 3. 7记录按附录B做好受体移植记录。DH 13/i553-2004附录A(规范性附录)供体羊采胚记录A. 1供体羊采胚后应按服表A. 1做好记录，表.1供体羊采胚记录畜主_供体羊耳号_与配公羊或冷冻精液来源本交或人工授精日期和次数第一次第二次_耳号第三次采胚时间黄体致胚胎类型从质盘采集胚胎总数桑槛胚鑫胚2细胞胚4细胞胚B细胞胚退化胚数数盘分级数盘分级数盘分级数量分级数量分级数里各注.(记录超数排卵所用的药物、方法没其他)DH 13/155-2004附录日(规范性附录)受体羊移植记录B. 1受体羊移植后应按表B. 1做好记录.表B. 1受体羊移植记录编号受休耳号品种及年龄移植地点发情时间移植时间胚龄、质世、数盘产羔情况备注
