1、ICS 65.120B 46DB13河 北 省 地 方 标准DB13/T 1091一2009饲料用酶制剂中酸性蛋白酶活力的测定分光光度法2009-06-17发布2009-07-02实施河北省质量技术r(.f:督局 发布DB13/T 1091-2009.山占.舀.目月Ii舀本标准由河北省畜牧兽医局提出。本标准起草单位:河北省饲料产品质量监督检验站、石家庄市畜产品质量监测中心。本标准主要起草人:武英利、王萍、左晓磊、王作艳、闻超、武利勇。DB13/T 1091-2009饲料用酶制剂中酸性蛋白酶活力的测定分光光度法1范围本标准规定了饲料用酶制剂中酸性蛋白酶活力的单位定义和测定方法。本标准适用于饲料用
2、酶制剂中酸性蛋白酶活力的测定。2规范性引用文件下列文件通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注明日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBIT 6682-2008分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1酸性蛋白酶活力单位在40C, pH3.0条件下，1 min水解酪素生成1 5g酪氨酸所需的酶的量，规定为一个酶活力单位。4原理蛋白酶水解酪素产生酪氨酸，在碱性条件下含有酚基的酪氨酸将福林试剂还原生成钥蓝
3、与钨蓝，溶液的颜色与酶解产生的酪氨酸的量成正比，而生成的酪氨酸的量与酶的活力成正比，用分光光度计测定其吸光度值，根据吸光度值计算其酶活力。5仪器和设备5.1分析天平:感量0.000 1 g05.2研钵。5.3容量瓶:50 mL, 100 mL05.4电炉:温度可调。5.5恒温水浴摇床:温控范围30土0.290-60土0.29C 05.6烧杯:200 mL, 250 mLo5.7砂芯玻璃滤器:孔径0.45 5m 05.8酸度计:精确至0.0105.9秒表。5.10移液器:精度10 Al.5.11分光光度计。5.12比色管:25 mL06试剂方法中所用试剂，除另有规定外均为分析纯试剂，所用水应符合
4、GB/T 6682-2008三级以上用水DB13/T 1091-2009要求。6.1浓盐酸。6.2磷酸(85%).6.3钨酸钠(Na2WO4.2H2O)o6.4钥酸钠(Na2MoO4.2H刃)。6.5硫酸锉。6.6浓澳水(99%).6.7碳酸钠。6.8三氯乙酸。6.9乳酸(80%-90%).6.10乳酸钠(70%).6.11酪素。6.12 L一酪氨酸标准品(含量大于99.0%)07溶液7.1福林试剂于2 000 mL磨口回流装置中加人钨酸钠(Na2WO4.2H2O) 100 g,钥酸钠(Na2MoO4.2H20) 25 g,水700 mL, 85%磷酸50 mL、浓盐酸100 mL，小火沸腾回
5、流10h，取下回流冷却器，在通风橱中加人硫酸铿( Li2SO4) 50 g、水50 mL和数滴浓澳水(99%)，再微沸15 min，以除去多余的澳(冷后仍有绿色需再加澳水，再煮沸除去过量的澳)，冷却，加水定容至1 000 mL。混匀，过滤。制得的试剂应呈金黄色，贮存于棕色瓶内。7.2福林工作溶液取一份福林试剂与二份水混合，摇匀即为福林工作溶液。7.3碳酸钠溶液，浓度0.4 mol/L称取无水碳酸钠42.4 g，用水溶解并定容至1 000 mLo7.4三级乙酸溶液，浓度0.4 mo此称取三氯乙酸“.4 g，用水溶解并定容至1 000 mLo7.5盐酸溶液，浓度0.1 mol几量取盐酸9 mL，用
6、水溶解并定容至1000 mLo7.6盐酸溶液，浓度，mol/L量取盐酸90mL，用水溶解并定容至1000 mLo7.7乳酸缓冲溶液，pH 3.0甲液 称取乳酸10.6 g，加水溶解并定容至1 000 mLo乙液 称取乳酸钠16 g，加水溶解并定容至1 000 mLo取甲液8 mL、乙液1 mL混合，加水9 mL稀释，摇匀即为pH 3.0的乳酸缓冲溶液。7.8酪素溶液，浓度10叭称取酪素lg置研钵中(精确至0.000 2 g)，加浓乳酸2-3滴湿润，研磨3 min，加入15 mL乳酸缓冲溶液，静置，将上清液转移至100 mL容量瓶中。残渣继续研磨至少3 min，加人10 mL乳酸缓冲溶液，静置，
7、将上清液转移至容量瓶中，如此重复至少3次，将酪素全部转移至容量瓶中。在沸水浴中加热至完全溶解，冷却后用乳酸缓冲溶液定容至刻度。此溶液在冰箱内49C贮存，有效期为3 da7.9卜酪氨酸工作溶液，浓度100 5岁mL称取预先于105干燥至恒重的L-酪氨酸0.100 0 g(精确至0.000 2 g)，用1 mol/L的盐酸溶液60 mL溶解后定容至100 mL容量瓶中，即为1 mg/ mL酪氨酸标准贮备溶液。DB13/T 1091-2009准确量取lm创mL酪氨酸标准贮备溶液10.00 mL置100 ML容量瓶中，用0.1 mol/L盐酸定容至刻度，即得到100 p g/ mL L-酪氨酸标准溶液
8、。8试样的选取和制备选取具有代表性的试样用四分法缩减至200 g，粉碎至0.25 mm，装人密封容器中，备用。9分析步骤9.，标准工作曲线的绘制9.1.1准确量取L-酪氨酸标准溶液0, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0 mL，分别置于6只 25 mL比色管中，加水定容至10 mL，即浓度为0, 10, 20, 30, 40, 50 5g/ mL的标准2作溶液。9.1.2分别取9.1.1 L-酪氨酸标准工作溶液1.00 mL置于另外6只25 mL比色管中，各加碳酸钠溶液5.00 mL,福林工作溶液1.00 mL，置40士0.2水浴中显色20 min(准确计时)，作为标准测试溶液。9
9、.1.3以0浓度标准测试溶液为空白对照，在680 nm波长处分别测定其吸光度。以吸光度A为横坐标，酪氨酸的量C为纵坐标，计算出标准曲线回归方程。9.2待测酶液的制备9.2.1称取试样0.5-2 g(精确至0.000 2 g)置研钵中，用少量乳酸缓冲液湿润，研磨至少3 min,加人15 mL乳酸缓冲溶液混匀，静置，将上层清液转移至100 mL容量瓶中。9.2.2沉渣部分继续研磨至少3分钟，加人10 mL乳酸缓冲溶液混匀，静置，将上层清液转移至容量瓶中。重复上述操作至少3次，将试样全部转移人容量瓶中，用乳酸缓冲溶液定容至刻度，摇匀(酶活力应控制在8 U/mL-10 U/mL范围内)供试验用。9.3
10、测定9.3.，样品空白测定溶液9.3.1.1准确量取9.2.2测定溶液(混悬溶液，摇匀后立即量取)I mL于25 mL比色管中，置温度409C10.29C、振摇速度100次/分钟的水浴摇床中预热2 min，加人2.00 mL三抓乙酸溶液，摇匀，再置上述水浴摇床中保温10 min(准确计时)。9.3.1.2取1.00 mL酪素溶液加人9.3.11比色管中，摇匀，静置10 min，用定量滤纸过滤，滤液备用。9.3.1.3准确量取9.3.1.2滤液1.00 mL置于另一比色管中，加碳酸钠溶液5.00 mL，加福林工作溶液1.00 mL,置温度40C10.29C、振摇速度100次/分钟的水浴摇床中显色
11、20 min(准确计时)，作为样品空白测试溶液。9.3.2样品测定溶液9.3.2.1准确量取9.2.2试验溶液(混悬溶液，摇匀后立即取样)1mL于25 mL比色管中，置温度40土0.29C、振摇速度100次/min的水浴摇床中预热2 min，然后，加1.00 mL酪素溶液，摇匀，置上述水浴摇床中保温10 min(准确计时)。9.3.2.2在9.3.2.1比色管中加人2.00 mL三抓乙酸溶液，摇匀，静置10 min，用定量滤纸过滤，滤液备用。9.3.2.3准确量取9.3.2.2滤液1.00 mL，加碳酸钠溶液5.00 mL，加福林工作溶液1.00 mL,置温度40土0.290、振摇速度100次
12、/min的水浴摇床中显色20 min(准确计时)，作为样品测试溶液。9.3.3测定以0浓度标准测试溶液为空白对照，在680 nm波长处测定样品空白测试溶液和样品测试溶液的吸收度，用标准曲线回归方程计算出对应的卜酪氨酸量。9.4结果计算与表迷9.4.1结果计算酸性蛋白酶活力按(1)式计算:DB13/T 1091-2009W xn10 x m(1)式中:X -酶活力单位，U/g;W用回归方程计算出的试祥溶液相当的卜璐氛酸t, Wg:n试样溶液总稀释倍数;10 -醉反应时间，min;M试样质量，g09.4.2结果表述每个样品应取2份平行样进行测定，取其算术平均值为分析结果，结果保留整数。10孟复性两平行测定结果的允许相对偏差不大于3.0%。
