1、 ICS 07.080 B 41 DB13 河 北 省 地 方 标 准 DB 13/T 20662014 牛胚胎性别鉴定技术规程 2014 - 09 - 02发布 2014 - 10 - 01实施 河北省质量技术监督局 发 布DB13/T 20662014 I 前 言 本标准根据GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由河北省畜牧兽医局提出。 本标准起草单位：石家庄天泉良种奶牛有限公司。 本标准起主要草人：余文莉、苗玉涛、李树静、冯春涛、陈龙、毕江华、刘潇。 DB13/T 20662014 1 牛胚胎性别鉴定技术规程 1 范围 本标准规定了牛早期胚胎性别鉴定的方法及操作程序。 本标准
2、适用于体内及体外生产的牛早期胚胎的性别鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。 NY/T 1445-2007 奶牛胚胎移植技术规程 中华人民共和国畜牧法（中华人民共和国主席令 第四十五号 2005年12月29日） 乳品质量安全监督管理条例(经2008年10月6日国务院第二十八次常务会议通过) 中华人民共和国专利法（中华人民共和国主席令 第八号2008年12月27日） 专利：牛Y染色体重复序列特异性引物及鉴定牛早期胚胎性别鉴定的PCR方法，(专利号ZL
3、200510011863.X) 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 胚胎 本标准中涉及的胚胎特指处于桑椹胚至扩张囊胚阶段的早期胚胎。 3.2 胚胎性别鉴定 对早期胚胎显微取样，将样品DNA进行PCR扩增，通过检测雄性特异性基因片段的方式判断胚胎性别。 3.3 YCD试剂盒 PCR扩增反应缓冲液，含有PCR反应所需的全部特异性引物、内标物、dNTP、Taq酶等。 4 体内胚胎的生产 参照NY/T 1445-2007的规定执行。 5 胚胎质量鉴定 DB13/T 20662014 2 5.1 胚胎获得 获取处于紧缩桑椹胚（M）、早期囊胚（EB）、囊胚（B）、扩张囊胚（EXB）发育期
4、的体内受精或体外受精胚胎。用形态学方法进行胚胎质量鉴定，将胚胎依次分为1、2、3、4四级，其中1、2级胚胎可用于性别鉴定。 5.2 鉴定标准 5.2.1 1级胚：发育正常，胚龄与发育阶段相吻合，卵裂球轮廓清楚，透明度适中，细胞密度大，卵裂均匀，无水疱样卵裂球，无变性的细胞。细胞变性率不超过15%。 5.2.2 2级胚：发育基本符合预定胚龄，轮廓清楚，明暗适中或稍暗或稍浅，细胞密度较小或小型卵裂球过多，有小部分突出的细胞和水泡样细胞，细胞变性率为15%50%。 5.2.3 3级胚：轮廓不清楚，色泽过暗或过淡，细胞密度小，突出细胞占一多半，细胞变性率为50%75%。 5.2.4 4级胚：未受精卵和
5、细胞变性率超过75%的胚胎。 6 操作程序 6.1 仪器与耗材 6.1.1 操作应包括以下仪器： a) 倒置显微镜； b) 胎分割仪； c) PCR仪； d) 电泳仪； e) 胚胎冷冻仪； f) 100L定量移液器； g) 2L20L可调微量移液器； h) 3L定量移液器。 6.1.2 耗材应包括： a) 取样吸头； b) 通用吸头； c) 分析管； d) 0.25mL细管； e) 细管塞； f) 细菌滤器； g) 6孔培养皿； h) 60mm培养皿； i) 35mm培养皿； j) 50TAE原液。 6.2 溶液 DB13/T 20662014 3 分为胚胎分割液、胚胎冷冻液、胚胎保存液。 溶
6、液配方见附录A。 6.3 操作步骤 6.3.1 样品分析管准备 启动超净工作台紫外灯消毒20min后关闭，打开通风开关，用2L20L可调微量移液器向样品分析管中加8L超纯水，两个管不能同时打开，加样后立即盖住盖子。 6.3.2 做胶 6.3.2.1 取20mL TAE原液，定容至1000mL，混匀。 6.3.2.2 将电泳槽调至水平，胶盘用透明胶带封好，把两套梳子放在胶盘上，把胶盘放在电泳槽上。 6.3.2.3 准备好包胶用的保鲜膜、锡泊纸和放杂物的卫生纸铺垫。 6.3.2.4 称3g琼脂糖放入250mL的锥形瓶中。 6.3.2.5 量取120mL TAE缓冲液倒入锥形瓶中，摇动、混匀。 6.
7、3.2.6 用一纸巾团松松地盖在锥形瓶上。 6.3.2.7 将锥形瓶放入微波炉，液体加热至沸腾35次至液体澄清，关闭微波炉静置3min。 6.3.2.8 带好手套，取出锥形瓶加入5L溴化乙锭，迅速摇匀。 6.3.2.9 在冷水中冷却至70，之后把琼脂糖浇在已准备好的胶盘上，待凝固完全后取掉梳子，取下胶盘包好，待用。 6.3.3 取样 6.3.3.1 仪器安装及调试 取出倒置显微镜，将操作手柄与切割仪连接。安装切割刀，使刀锋与显微镜台面平行，刀体与显微镜台面垂直。 6.3.3.2 平皿的准备 洗刀平皿：在4个35mm培养皿中依次加入3mL超纯水、3mL无水乙醇、3mL超纯水、2mL胚胎分割液。
8、洗胚平皿：在6孔培养皿中依次加入孔1.5mL2mL保存液（放置取样前胚胎）、孔1.5mL2mL胚胎分割液（做切割滴）、孔1.5mL2mL胚胎分割液（洗取样前胚胎）、孔1.5mL2mL胚胎保存液（回收切割后胚胎）。 胚胎存放皿：6孔培养皿每孔中放1.5mL2mL保存液，在底盘各孔的边缘写好相应的胚胎序号。 6.3.3.3 样品分析管的标记 样品分析管标号为日期序号和胚胎序号两部分组成，胚胎序号用记号笔写在分析管盖及管身，与取样后胚胎存放皿的序号一致，日期号写在管身下部，只写日期中的“日”号即可。 6.3.3.4 洗切割刀片 用准备好的洗刀平皿依次将刀浸入，超纯水、无水乙醇、超纯水、胚胎分割液。
9、DB13/T 20662014 4 6.3.3.5 胚胎取样前的准备 在60mm培养皿的外底部边缘标记做滴方向，用100L定量移液器从性别鉴定洗胚皿孔中吸取胚胎分割液做切割小滴，之后从性别鉴定洗胚皿孔胚胎保存液中吸取1枚胚胎放入孔胚胎分割液中吹洗35次，再将此胚胎吸起放到切割小滴正中。 6.3.3.6 胚胎切割 按下列要求进行： a) 将切割小滴中的胚胎放入倒置显微镜物镜正上方，调整焦距使胚胎轮廓清晰，将切割刀缓缓放下，之后操作电动胚胎分割仪对胚胎进行取样； b) 囊胚切取内细胞团对面的滋养层细胞，桑椹胚没有具体部位要求，取样细胞数为5个左右，操作时应轻缓。取样图参见附录C。 6.3.3.7
10、胚胎取样及回收 按下列要求进行： a) 胚胎切割完成后，用3L微量移液器插上取样洗头吸取胚胎回收液，将吸头尖部对准样品将之吸入，加入到已标好序号的样品管中，盖紧样品分析管，马上浸入液氮速冻。取样后的胚胎放入对应序号的胚胎存放皿中； b) 每取一个样换一个吸头，每分割完一枚胚胎都要核对样品管序号与胚胎序号是否一致。 6.3.3.8 加 YCD 试剂盒 根据取样胚胎的数量和3个对照组（N：空白对照，F:雌性对照，M：雄性对照）计算YCD的需要量，用2l20l可调微量移液器，向每个样品分析管中加入8.5l YCD。每加一个样换一个胚胎吸头。 6.4 DNA扩增 将加好YCD的样品按顺序放入PCR仪中
11、，启动PCR仪，计时60min。具体扩增程序参照附录B。 6.5 电泳 6.5.1 带好乳胶手套，安装电泳槽并调至水平。 6.5.2 取出一块胶，平放在胶盘上。 6.5.3 向电泳槽中倒入TAE溶液，液面高出胶面约0.8cm1.0cm。 6.5.4 按顺序取出样品分析管，摆在支架上。 6.5.5 用微量移液器，吸取约5L甲酚红放入样品管，稍加混匀。 6.5.6 吸取约20L样品进行点样，加一个样换一个吸头。 6.5.7 点样完成后打开电源，将电压调至138 V140V，17min后关闭电源。 6.6 显影 将胶块从电泳槽中取出，放到紫外显影仪上观察电泳结果并拍照留存。 6.7 标记结果 DB1
12、3/T 20662014 5 在照片上标出鉴定结果（F：雌性；M：雄性；N：空白对照或没反应），参照附录C。 6.8 清除实验残留物 6.8.1 将适量漂白剂倒入电泳槽，把胶、样品管一起放入。沾取漂白浸液擦拭仪器表面，把胶块等全部放入手套中倒入废物箱。 6.8.2 凡接触与PCR反应和电泳有关的物品均戴手套，凡接触过与胶有关的物品的手套不能再拿其他物品；凡所有与PCR反应和电泳有关的物品不论使用还是存放都有固定位置，以防交叉污染；凡与PCR反应和电泳有关的垃圾必须集中放置，及时销毁。污水必须经过漂白剂处理后倒入排污系统，如厕所；制胶所用物品必须标明危险字样，单独保存。 6.9 记录 记录格式见附录D。 6.10 胚胎移植或冷冻 6.10.1 进行鲜胚移植时，将鉴定后结果标在胚胎存放皿上，选择所需性别胚胎，装管，移植。 6.10.2 只生产冷冻胚胎时，可在切割取样后3h内直接将胚胎冷冻保存，待获得鉴定结果后再将雌、雄胚胎分开。 6.10.3 胚胎冷冻及移植程序按NY/T 1445-2007执行。 _
