1、ICS 65.020.01 B 61 DB13 河北省 地方标准 DB13/T 2596 2017 苹果组培苗繁育技术规程 2017 - 11 - 22 发布 2017 - 12 - 22 实施 河北省质量技术监督局 发布 DB13/T 2596 2017 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由河北农业大学提出。 本标准起草单位：河北农业大学 。 本标准主要起草人：师校欣 、 杜国强 、 高仪 、 杨丽丽 、 许建锋 、 王燕霞 、 张莹 、刘婉君、成晓华。 DB13/T 2596 2017 1 苹果组 培苗 繁育 技术规程 1 范围 本标准规定了苹果品种
2、和砧木 （ Malus spp.） 组织培养 繁育 过程中 的术语和定义、苹果组培苗生产设施、 培养基制备、组培室消毒灭菌、苹果组培苗生产、组培苗质量标准、包装、标签和运输等 方面的 操作规程。 本标准适用于苹果品种和砧木组织培养 繁育苗木 。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 9847 苹果苗木 LY/T 1882-2010 林木组织培 养育苗技术规程 NY/T 1085-2006 苹果苗木繁育技术规程 NY/T 2306-2013 花卉种苗组
3、培快繁技术规程 NY/T 2719-2015 苹果苗木脱毒技术规范 3 术语和定义 LY/T 1882-2010、 NY/T 2306-2013等界定的 以及 下列术语和定义适用于本文件 。 为便于使用，以下重复列出了 LY/T 1882-2010、 NY/T 2306-2013中的 某 些术语和定义。 3.1 植物组织培养 plant tissue culture 在无菌条件下，将离体的植物器官、组织、细胞以及原生质体 ，在人工培养基和人工控制的环境中，使其再生新植株的过程和技术。 LY/T 1882-2010， 定义 3.2 3.2 茎尖培养 meristem culture 以植物茎尖为
4、外植体，通过组织培养的方式获得完整植株的一种生物技术。一般用来进行脱毒种苗的生产，以获得不含检疫及影响植物正常生长的病毒的植株。 NY/T 2306-2013， 定义 3.4 3.3 培养基 medium 根据植物营养原理和植物组织培养的要求，人工配制的营养基质。 LY/T 1882-2010， 定义 3.4 DB13/T 2596 2017 2 3.4 培养基母液 medium stock solution 按试剂种类和性质分别配制的高于培养基配方浓度的溶液。 LY/T 1882-2010，定义 3.5 3.5 灭菌 sterilization 通过物理、化学及一些理化方法，杀灭一切微生物（
5、包括孢子等）的过程。 NY/T 2306-2013，定义 3.5 3.6 消毒 disinfection 通过物理、化学 方法去除物体表面大部分有害病原微生物（孢子除外）的过程。 NY/T 2306-2013，定义 3.10 3.7 外植体 explant 从自然生长的活体植物上获取的用于建立植物组培快繁体系的起始材 料。 NY/T 2306-2013，定义 3.8 3.8 接种 inoculation 在无菌条件下将 消毒 后的外植体或 继代、生根 组培材料接入培养基的过程。 注： 改写 NY/T 2306-2013，定义 3.3。 3.9 初代培养 explant culture 采集外植
6、体并对其进行消毒接种，将其置于适宜的培养条件下，启动生长、获得最初的无菌培养材料的过程。 3.10 继代培养 subculture 外植体经初代培养后，再次以及以后各次接种于新培养基继续培养的过程。 LY/T 1882-2010，定义 3.7 3.11 丛梢 shoot clump 在适宜条件下，外植体的顶芽或腋芽萌发形成的嫩梢会长出新的腋芽，腋芽又不断萌发出嫩梢，此过程重复发生而形成 的多芽多梢的 集合体。 DB13/T 2596 2017 3 3.12 试管苗 plantlet in vitro 通过组织培养方法获得的培养容器中的 培养材料。包括外植体初代培养、继代培养、生根培养各阶段的组
7、培材料。 注： 改写 NY/T 2306-2013，定义 3.7。 3.13 组培苗 plant propagated via tissue culture 利用植物组织、器官或细胞等作为起始材料，通过植物组织培养方式生产获得的植株。 NY/T 2306-2013，定义 3.12 4 苹果组培苗生产设施 苹果组培 苗繁育 实验室或组培 生产 工厂应包括培养基制备室、洗涤室、灭菌室、接种室、培养室、制水室、储存室（仓 库）、温室或大棚等部分，面积可视工作 （生产） 规模确定。 5 培养基制 备 5.1 培养基配方 5.1.1 基本培养基采用 MS 培养基或 C17培养基，具体成分 分别 见附录
8、A 中 的表 A.1 和 附录 B 中 的表B.1。 5.1.2 外植体 初代 培养基 新红星等元帅系品种 ： C17 + 6-苄基腺嘌呤（ 6-BA） 0.5 mg/L + 吲哚丁酸（ IBA） 0.2 mg/L + 水解酪蛋白（ CH） 300 mg/L + 蔗糖 30 g/L + 固化剂（能使培养基凝固的最低用量，视固化剂种类确定）。 除元帅系外的其它苹果品种和砧木： MS + 6-BA 0.5 mg/L 1.0 mg/L + 萘乙酸（ NAA） 0.05 mg/L + 蔗糖 35 g/L + 固化剂（能使培养基凝固的最低用量，视固化剂种类确定）。 5.1.3 继代培养基：基本培养基 M
9、S（ C17） + 6-BA1.0 mg/L 3.0 mg/L + NAA0.05 mg/L + 蔗糖 35 g/L + 固化剂 （同 5.1.2）。 5.1.4 生根培养基： 1/2MS（ 1/2C17） + IBA 0.3 mg/L0.6 mg/L + 吲哚乙酸（ IAA） 1.0 mg/L + 蔗糖 25 g/L + 固化剂 （同 5.1.2） 。 5.1.5 不同苹果品种 或砧木 组织培养时，培养基中生长调节物质的浓度可根据以上配方给出的浓度范围适当调整。 5.1.6 为降低成本，蔗糖可用等量食用白砂糖代替。 5.2 母液配制 5.2.1 母液配制选用化学纯以上纯度 的 化学试剂 ，
10、使用蒸馏水或去离子水。 DB13/T 2596 2017 4 5.2.2 根据附录 A 中 表 A.1 和 附录 B 中 表 B.1 的 基本培养基配方 成分分组和浓度扩大倍数，分别配制大量元素（ 50 倍）母液、钙元素（ 50 倍）母液、微量元素 -1（ 200 倍）母液、微量元素 -2（ 500 倍）母液、铁元素（ 100 倍）母液和有机物（ 100 倍）母液。 5.2.3 植物生长调节物质配制 成单一 成 分母液，浓度以方便使用为原则， 一般 为 0.1 mg/ml 0.5 mg/ml。 5.2.4 培养基母液试剂瓶分别贴上标签，标注母液名称、配制倍数和日期，置于 冰箱冷藏 保存。有机物
11、 母液 、铁 元素母液 和植物生长调节物质母液应储存在棕色试剂瓶中。 5.3 培养基配制程序 5.3.1 根据培养基配方与培养基配制数量，计算各种母液的用量 及配方中其它成分 的用量，登记在册，以备查证。 5.3.2 按照计算结果称量固化剂与蔗糖（ 或白砂糖 ），加入已温热的蒸馏水中，蒸馏水的量 以 培养基配制 体积 的 1/2 2/3 为宜 ， 不断 搅拌 ， 熬至沸腾。 5.3.3 在熬开的锅内 加入 相应 母液，加蒸馏水定容 ， 充分搅拌均匀。 5.3.4 用 1.0 mol/L 盐酸或 1.0 mol/L 氢氧化钠调节 pH 值至 5.8 6.0。 5.3.5 将培养基分装到培养容器中
12、，用封口膜 、 封口盖或棉塞加牛皮纸封口 。 5.3.6 将培养基放入高压蒸汽灭菌 器 内灭菌。灭菌温度 121 ，灭菌时间 20 min。 5.3.7 灭菌后的培养基在干净、阴凉的室内常温 平放 保存，保存时间不 宜 超过 2 周 。 6 组培室消毒灭菌工作细则 组培室保持清洁卫生，消毒灭菌工作细则 参见 附录 C。 7 苹果组培苗生产 7.1 无菌接种操作 7.1.1 利 用超净工作台 提供的无菌环境进行接种， 使用超净工作台接种前应提前 20 min 开机 及紫外灯。接种前关闭紫外灯， 用 75 %的酒精擦拭工作台台面及玻璃内壁。 7.1.2 用于切分外植体或无菌组培材料的培养皿 、不锈
13、钢小盘等需事先 高压灭菌 。 7.1.3 刀、镊子等接种工具用酒精擦拭或浸泡，再用电热接种工具灭菌器（ 280 320 ）或酒精灯灼烧灭菌后， 置搁置台上 冷却至常温使用。 7.2 外植体 初代 培养 7.2.1 外植体采集 及处理 7.2.1.1 选择 品种纯正或砧木类型一致、 性状稳定、生长健壮、无病虫危害和机械损伤的 植株。 DB13/T 2596 2017 5 7.2.1.2 在春季采集由叶芽萌发长出几片小幼叶的幼嫩新梢、未木质化 或半木质化新梢，去除新梢上展开的叶片，未展开的小幼叶可不去除。亦可 选用一年生枝 ， 将基部浸于水中室内催芽 ，待叶芽萌动长出幼嫩新梢后及时采集。 7.2.
14、1.3 将外植体表面用自来水冲洗干净，较长新梢剪段，置于瓶中。 7.2.2 外植体消毒 7.2.2.1 按照 7.1 的 要求 准备好超净工作台及接种工具。 7.2.2.2 使用 5 %次氯酸钠溶液，消毒时间 10 min 15 min；使用 0.1 %氯化汞溶液，消毒时间 6 min 15 min。消毒时间可根据材料的幼嫩程度、洁净程度适当调整。 7.2.2.3 消毒期间多次晃动消毒容器，以保证外植体与消毒剂充分接触。 7.2.2.4 外植体消毒完成后，用无菌水冲洗 4 遍以上。 7.2.2.5 使用过的氯化汞废液禁止随意倾倒，应妥善收集保存，交由当地环保部门处理。 7.2.3 外植体 切分
15、 接种 7.2.3.1 长度 1 cm 以下的幼嫩新梢去掉外围叶片，基部切出新鲜切口， 接入培养基 ；较长的新梢 切单节茎段 ，节位密集时，亦可切双节或多节茎段接种。 7.2.3.2 每瓶接 1 个 3 个 外植体 ，要求分布均匀，深浅适中 。 7.2.3.3 封好瓶口后，注明品种代号、接种人员、接种日期等 ， 放 至 培养室培养。 7.2.3.4 外植体出现褐化时要频繁多次转接，减轻毒害。 7.2.3.5 元帅系品种初代 培养较难 ， 可 在 接种后常规培养 1 周，然后 暗培养 1 周，再 常规培养。暗培养可将材 料置于培养室中的暗培养橱， 或 在培养架用黑布遮盖。 7.2.3.6 利用茎
16、尖培养脱除病毒培育无病毒原种和无病毒苗时， 应剥取 0.1 mm 0.2 mm 的茎尖分生组织 （带 1 个或 2 个叶原基）作为外植体 接种。 7.3 继代与增殖培养 7.3.1 将 初代或继代 培养 材料 ，去除基部愈伤组织、老化组织及生长不良的组织，切分成 0.5 cm1.5 cm 大小的丛梢或茎段， 接入继代培养基， 置于 培养室培养。 7.3.2 接种数量根据培养容器的大小决定，要求材料摆布均匀，间距 1.0 cm 2.0 cm。 7.3.3 培养 4 周 6 周 ，继代苗 生长缓慢 至 停长 时，及时进行继代 转接 。 个别苹果品种或砧木（ 如苹果砧木难咽等） 继代苗停长后衰老速度
17、较快， 应 适当缩短继代间隔时间。 7.3.4 继代增殖阶段，如遇 继代 苗发生 “ 玻璃化 ” ，在继代培养基中 添加 1 g/L 3 g/L 聚乙烯醇（ PVA） ，可有效防止玻璃 苗发 生 ， 也可使部分玻璃化程度较轻的试管苗恢复正常 。 7.4 生根培养 7.4.1 继代 培养 4 周 6 周 后，切取长度大于 2 cm 的 单根 粗壮嫩 梢插入生根培养基， 接种数量参见7.3.2。 DB13/T 2596 2017 6 7.4.2 接种后 放 至 培养室培养 ，元帅系 品种先 暗培养 1 周，再常规 培养 ，有助于提高生根效果。 7.4.3 富士等多数苹果品种需连续继代培养 8 代
18、10 代以上才能获得较高 且稳定 的生根率。 7.5 培养条件 外植体 初代 培养、继代增殖、生根培养各阶段 的 接种材料均放 至 培养室培养，培养条件为，温度：（ 252） ，光照强度： 1500 Lx 2000 Lx，光周期： 14 h 16 h光照 时间， 8 h 10 h黑暗 时间 。 7.6 试管 苗移栽 7.6.1 移栽 适宜 条件 生根苗出瓶移栽应先在温室（或大棚）进行 锻炼和 过渡移栽。温室（或大棚）的 最 适温 度 25 ，最低温 度 10 ，最高温 度 10 cm，从移栽容器中倒出， 带 基质 土坨移栽至田间 。 7.6.6.3 移栽前加强通风 炼苗，控制 浇水 。 高温季
19、节移栽 应 适当遮阴。 7.7 苹果无病毒苗培育 脱毒方法及病毒检测方法按 NY/T 2719-2015执行 。经病毒检测确认脱除了病毒的材料进行组织培养 繁 育 可 按照 7的规定 执行。 DB13/T 2596 2017 7 8 试管苗及 组培苗质量标准 8.1 试管苗 质量标准 适宜出瓶移栽的合格试管苗应无污染 ， 具有 3条以上不定根，根长适中， 最好有侧根发出， 幼茎粗壮 ，茎基部没有或仅有少量 愈伤 组织，叶片发育良好，无黄叶，无枯尖。 8.2 组培苗质量标准 出圃的组培苗质量标准按 GB 9847执行。 9 包装、标签和运输 9.1 试管 苗 包装、标签和运输 试管 苗应放于泡沫
20、箱中，用填充物固定好，高温季节加冰袋，泡沫箱用胶带密封 。 标签标明品种、瓶苗数量、包装时间等 。码放禁止 上下倒置 ， 运输过程 避免 剧烈颠簸。 9.2 组培 苗 包装、标签和运输 组培苗的包装、标签和 运输 按 照 GB 9847的 规定执行 。 DB13/T 2596 2017 8 附 录 A （规范性附录） MS 基本培养基配方 表 A.1规定 了 MS培养基 的配方。 表 A.1 MS 培养基成分及母液配制表 母液种类及倍数 试剂 配方规定量 mg/L 配制 1 升母液所需量 g 大量元素 50x KNO3 1900 95 NH4NO3 1650 82.5 MgSO47H2O 37
21、0 18.5 KH2PO4 170 8.5 钙 元素 50x CaCl22H2O 440 22 铁元素 100x Na2EDTA2H2O 37.3 3.73 FeSO47H2O 27.8 2.78 有机物 100x VB1 0.1 0.01 VB6 0.5 0.05 烟酸 0.5 0.05 甘氨酸 2 0.2 肌醇 100 10 微量元素 -1 200x MnSO44H2O 22.3 4.46 ZnSO47H2O 8.6 1.72 H3BO3 6.2 1.24 KI 0.83 0.166 微量元素 -2 500x Na2MoO42H2O 0.25 0.125 CuSO45H2O 0.025 0
22、.0125 CoCl26H2O 0.025 0.0125 DB13/T 2596 2017 9 附 录 B （规范性附录） C17基本培养基配方（适合元帅系品种） 表 B.1规定 了 C17培养基的配方。 表 B.1 C17培养基成分及母液配制表 母液倍数 试剂 配方规定量 mg/L 配制 1 升母液所需量 g 大量元素 50x KNO3 1400 70 NH4NO3 300 15 MgSO47H2O 150 7.5 KH2PO4 400 20 钙 元素 50x CaCl22H2O 150 7.5 铁元素 100x FeSO47H2O 27.85 2.79 Na2EDTA2H2O 37.25
23、3.73 有机物 100x 甘氨酸 2 0.2 烟酸 0.5 0.05 VB1 1 0.1 VB6 0.5 0.05 D-生物素 1.5 0.15 微量元素 -1 200x MnSO44H2O 11.2 2.24 ZnSO47H2O 8.6 1.72 H3BO3 6.2 1.24 KI 0.83 0.166 微量元素 -2 500x CuSO45H2O 0.025 0.0125 CoCl26H2O 0.025 0.0125 DB13/T 2596 2017 10 附 录 C （资料性附录） 组培室消毒灭菌工作细则 C.1 接种室消毒灭菌工作细则 C.1.1 每天清洁接种室地面、窗台、超净工作台
24、等，去除灰尘污物。 C.1.2 晴朗、无风或微风、无雾霾或其它污染物的良好天气时，可开窗通风 0.5 h 1 h。 C.1.3 按照每 15 m2配置 1 根 30 w 紫外灯，每 1 g 臭氧可杀菌 20 m3的标准，每天用紫外灯照射杀菌1 h，每周 2 次 3 次臭氧消毒。杀菌时切勿进入，注意安全。 C.1.4 每周用 75%酒精溶液作喷雾降尘处理 1 次，用 84 消毒 液拖地消毒 1 次。 C.1.5 定期（一般 2 个 3 个月）清洁超净工作台的初级过滤 网或 无纺布。 C.1.6 每月清洁空调过滤网 1 次。 C.1.7 每月清洗接种工具灭菌器内石英珠 1 次，清洗时加洗洁精搓洗，
25、无明显黑渍后用清水冲洗干净，自然晾干后继续使用。 C.2 培养室消毒灭菌工作细则 C.2.1 每天清洁地面、窗台、培养架面等，去除灰尘污物。 C.2.2 晴朗、无风或微风、无雾霾或其它污染物的良好天气时，可开窗通风 0.5 h 1 h。 C.2.3 每周用 84 消毒液拖地消毒 1 次。 C.2.4 每周分别用紫外灯照射杀 菌 1 h、臭氧消毒 1 次。 C.2.5 每天观察、及时 清理污染的试管苗，污染材料需高压灭菌后再清洗。 C.2.6 每月清洁空调过滤网 2 次。 C.3 培养基制备室、洗涤室、灭菌室、工作区域走廊消毒灭菌工作细则 C.3.1 每天清洁地面、窗台、工作台面、各类物体表面等，去除灰尘污物。 C.3.2 晴朗、无风或微风、无雾霾或其它污染物的良好天气时，可开窗通风 0.5 h 1 h。 C.3.3 每周用 84 消毒液拖地消毒 1 次。 C.3.4 每月臭氧消毒 1 次。
