1、多“3DR1303河北省秦皇岛市地方标准DB 1 .303/7 125-2001绵羊的胚胎移植技术规程2001-10-11发布1001一10-11实施秦皇岛市质量技术监督局发布DB 1303厅125-2001月Ij舌胚胎移植技术是改P. X,品种的一项高新技术，它不但可以充分发挥公tr的遗传潜力，还可以使母畜的繁殖潜力得以充分发挥，从而提高家畜品种质量和促进高产、优质、高效畜牧业生产.为进一步扩大该项技术的推广规模，实现技术的标准化，在我市绵羊胚胎移植取得成功的基础上，根据国内外有关文献资料，特制定本标准.本标准由举皇岛市畜牧局提出。本标准在秦皇岛市，牧局归口.本标准由秦皇岛市，收工作站起草。
2、本标准的主要起草人:郑庆丰.鲍淑琴。郭瑞芬.李兵、李志才本标准自发布之日起实施。DH 1303厅123-2001绵羊的胚胎移植技术规程范围本标准规定了绵羊的胚胎生产和移植的供体羊的选择和饲养管理、供体羊的超数排卵及人工授精、手术冲卵技术及胚胎质量鉴定.冻胚的解冻，受体羊的选择及饲养管理、胚胎手术移植技术和妊娠受体羊的饲养管理技术。本标准适用于秦皇岛地区绵羊的胚胎生产和移植。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条欲.凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本.凡
3、是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。Ds 1303/T 098-2000羊的人2长精技术场作规程V供体羊的选择和饲养份理3，供体羊的选择3)体羊品种优良.生产性能好:b)传性称定.璐系清姚:)体质健壮.萦殖机能正常，无遮传和传染性佚病.年龄在2岁至7岁为宜;d)具有，收部门顺发的种，禽鉴定合格证书.3.2供体羊的饲养，理3.2.，保持饲养环境碑定，词养环境卫生，干级.翻舍沮度适宜.逻免应激反应。3.2.2制定合理的供体羊日报砚方.保证正常的营养平衡.3.2.3满足供体羊清洁饮水的书要。4供体羊的超数排即及人工授栩4.1超数排卵4. I!超数排即的季节和发情周期:编羊最通超数排卵季节为
4、9月下旬玉11月上旬.锦羊的发情周期在T5d-17. 5d.供体母羊在超数排卵前需观察1-2个完整的发情周期.4. 1. 2用于超数排卵的激素选择FSH-P(垂体促滤泡素)LH-P(垂体促黄体生成索)ICIS0996(氯前列娜醉)3激素剂量(注射总里/只)FSH-P剂量(肌注):120IU-160IULH-PYPjJt-根据FSH的it射剂t，肌往10。一120IU.ICI80996: MAO., 08mg/次，注射两次/d.4.，4超数排梦万* :ZFSH-P 3天注射法以母羊发情之日作为发情周期的Od，在母羊发情周期的第13d或13. 5d(周期大于工7. 5d的羊在第13. 5d)开始，
5、每天早:(6: 00-7: 00)和晚(18: 00-19: 00)各注射I次FSH.连纷3天，递减注射.ASH.川用生理盐水稀释。DB 1303厅125-2001在第5. 6次注射FSH-P时，同时肌肉注射ICI80996.确定供体羊发情后立即注射LH.如果FSH-P未注射完供体羊己发情.停止注射FSH-P，立即注射LH.13141516171201U早6: 00-7: 00FSH25 IUFSH20 IUFSH 15 IUIC180996 O.ORmg发情人.ILH: 100单位发情A.1晚18: 00-19: 00FSH25 IUFSH20 IUFSH 15 IUIC180996 0.0
6、8mg发惰人.I发情人.11261U早6: 00一7: 00陀H25 IUFSH20工UFSH 18 iUIC180996 0.08mg发情A. I比:100单位发情.1晚I8: 00-191 00陀H25 IU阳H20 IUFSH 18 IUICI80996 0.08at发情A. I发情.I4 1 S供体羊发情鉴定在第6次注射RSH-P时即对超排供体羊观察发情。观察时间:早(6: 00-7: 00)，晚(18:00).观察方法:试情公羊扎好试情布，站立接受试情公羊爬跨作为发情的标准。42人工授精2下种公羊的选择标准品种忱k，潜系清楚.遗传性称定.的规定。2,2人工授推操作要求放入母羊群中试情
7、，每30-40只供体羊需1只试情公羊.00-19:以母羊生r性能R好.健康无病.精液品质符合DH 1303/T 098一2000A)采栩前刘种公羊外生殆答清洗消毒。采精，精浪稀释、b)稀释后的精浪谧度妥保持在25一30的环境中。c)物精前，母羊外阴部必须经过清洗消套。物精用的器皿严格灭曲、消母。d)物入的鲜精技精精液活力在0.7以上次。，每次物梢有效精子教不少于30 X 100.轴精次数不少于2e)选择合适的物精枪和准确的物精部位。4.2.3人工授精的通遣台时间确认发情时立即进行第一次物精，之后每间隔12h物精1次，一般物2-3次。5手术冲即技术及胚胎质里鉴定5. 1手术冲口日5.!1所需主要
8、器材手术台1:弟组须刀1:剪1:止血钳3-4:巾帕钳4合针;镊子2;巾I20mdt表面皿创布:.持针器2-3块:止血纱布若千:剪毛剪1:1:肠钳(带乳胶管)1:手术刀片手术刀柄1:手术若千;缝合线:缝若千;中I80mm表面皿I8#-20#头皮针(尖端磨钝)若千:fi 10mm透明硅胶管( 8.玻璃管若千:4b 35mm培养器若千.5.，.2冲卯所需蕊品: 6#-8#头皮针(尖端磨钝)若千:若千:10m1注射器2-3:20m1注射器2-3:酒精、碘盯、新洁尔灭、。996生理盐水，青霉素、链霉素，液体石蜡，肝素冲卵液(保存液)的准备DB 1303厅125-2001购宜杜民碑赞捉冲戒(PBS)，PB
9、S液中加。.4%的牛血清白蛋白即为保存液可用干胚胎的体外操作和保存，也可直接作为冲卯掖使用于手术法冲胚和移植.5. 1.4手术冲卵技术步骤按附秒傲好采胚记录5. 1.4. 1制作喇叭口导卵管a)将fi 8mm的玻璃管断成10 cm-12二长度，洗净，烘千。b)将坡琦管户段放在酒精灯上灼烧，拉长为10cm,直径约3二一4mm即可c)冷却后将中间拉细部分截断，将截下部分的一端(巾3 mm)在酒精灯上烧结圆滑，但不能变形.d)在离圆滑端3cm处，用酒精灯缓慢加热.使之有曲成王2。“即可。5. 1.4.2手术冲卵法5. 1.4.2.，手术前24h停止饲喂草料，只面足饮水。5.，.4.2。2保定、琳醉:
10、将母羊仰卧保定，局部肺醉.5.1-4.2.3手术部位:在离教演前端约2“处，业中线的两侧均可.5. 1.4.2.4术部剪毛:剪毛范围约20cm X 20cm.用肥皂水清洗手术部.同时用剃须刀剃净毛茬.再用清水洗净。5.i.4.2.5术部消衡:首先用。.伟的新沽尔灭清洗手术部位:然后用5%腆盯棉球对手术部位由中心向外扩散消毒.凉千:级后用?5%酒精柿球对手术部位由里到外消毒.脱碘.凉千.5. 1.4.2.6通开血份，用手术刀于术部纵向切开Gem-8cm长的刀口.将皮下结缔组织分丙，.书肌脱，5. f. 4. 2. 7用手术刀将肌脱轻径切开:拐盆刃【肉层，再用刀柄后端将肌肉层和腹艘钝性剥离开.51
11、428在骨盆加.盼肤周日触摸子宫角井将卵里.子官引出切口外.分别记早两侧卵崖黄体和旅泡数。5. f 4 2.9愉梦8傲;中胚在超捕母羊发情后6611一7;h从输kip管采效2-8细胞胚胎，进行群胚移植。方法:用6共-911头皮针从子宫物卵管接合部的子宫端导入到轴卵管峡邻，将喇叭口导卵甘从物卯骨喇叭口摘入3cu-4cm.导卯甘远峭与21加.表面皿相接，助手事先用loml注射招抽取翻卜Bml冲卵袱，与头皮针相佳，把冲卯浪级级推入物卵管.胚胎即艘同冲卵浪自物卵管回收到表面皿中，.另一侧物卵管冲胚操作方法间上.5.，4.2. 10冲胚完毕后，用一定浓度的肝滚溶液喻洗内肚，洗掉粗血块。用25C-3O的生
12、理盆水将内脏冲珠千净.将，耐一，Oml (2510-30七)灭菌液体石蜡注入腹腔，以防枯连二5. t. 4. 2. 11供体母羊创口采用三层缝合法。即腹簇。肌肉连续缝合:皮肤结节缝合，针脚间距传。在肌肉与皮肤间撒适里，、链碑筑粉，以防创口感染.5，.4.2. 12手术后母羊需观察24小时后才能跟群放牧。手术器械在使用前用0.596新沽尔灭液浸泡0. 5h:术者分工要明确，严格按外科手术规则进行自身消毒.不得接触其他无关的物品:整个采胚过程的操作要迅速、准确、仔细，避免生猎器官界露过久，切记频萦，重复触摸和拉址生殖器官，以防脏器粘连。5).2胚胎质最鉴定5.2t检卵把盛有冲卵回收液的表面皿放在立
13、体显微镜下，仔细观察，不可遗漏，将检出的胚胎放入盛有保存液的“ 35m培养皿中丫超排母羊发情后66h-72h用输卵管冲胚法采集2细胞，4细胞，8细抱及少数16细抱胚胎，上述发Jim按由际胚胎移植协会规定的数码均表示为2.5.2.2胚胎的成最鉴定一形态学方法处于发育期2细胞的胚脂.期裂球轮廓清楚，球体饱AI进明度适中，数目吻合即可定为1级:1/3印裂球死亡可定为2级;加介裂球死亡可定为3级:其余定为4级.1，:，3级胚胎均可用于鲜胚移植.冻胚的解冻OB1303厅125-2001进行冻胚移植时，购置的冷冻胚胎在移植前需进行解冻操作。B. 1胚胎解冻所需的仪器、器材立体显微镜，温度计、解冻用水杯，0
14、. 25ml塑料细管、吸卵管，细管推杆，装管器.q l00mm塑料培养皿、0.22 um针头式细菌浦器。6.2胚胎解冻所需溶液保存液:含0.4%牛血清白蛋白的PBS液。解冻液:1M蔗糖/保存液。6.3胚胎解冻方法胚胎解栋方法应根据胚胎冷冻方法而定，一般采取的方法是1. 5m乙二醉/保存摧(含1V蔗糖)冷冻胚胎的解冻:胚胎-32水浴10秒一娜千细管一用70%酒精柿球攘拭细管，晾千一剪去细管塞一移植(胚胎解冻后2-3分钟内移入里体)。已4胚胎发有期与受体移植时间的对应关不眨胎发育期受林移植时间(发情之日为Oh)紧缩桑柑胚(川5.5土0. 5d早期级胚(四)5. 510. 5d级胚(B) 6.0土0
15、. 5d扩张班胚(E%B)6.5土0. 5d7受体羊的选择及饲养管理里求，.1受体羊的选择4)情周期，无萦殆机能疾病.经检痰无佑染疾病，健族、膝情在七成以上。b)年龄在1.5岁-6岁之间。7.2受体羊的润界共求受体羊单独组群加吸饲葬，保持环境相对称定.过免应傲反应.日胚胎年术移植技术8.，受体羊的同娜化发情处班8.1.1同期化发情处理方法药品:ICIS0996(抓前列娜醉).0.2mg/2m1/支VIA: 0. 07mg/只/次方法:二次注射法(肌注)第一次注射在任I-天:第二次注射在第一次注射后7d.第二次注射后24-96h观察发情.受体羊发情之日为Od.按胚龄要求进行移植。S. 1.2 2
16、细俄-扩张班胚的胚胎.鲜胚移植时供、受体羊发情的同朋化要求8.1.2.，供.受体羊均采用试情公羊确认发情。观察时问:每夭早，晚各一次。8. 1. 2.2把供体羊发情之日定为O与供体羊同时发情的受体羊定为Oh受体.比供体羊提前12h发情的定为+12h受体，提前.24h的定为+24h受体.比供体羊推迟12h发情的受体定为一12h受体，推迟24h的定为-24h受体、引.2.3鲜胚移植时4h受体，士12h受体移植效果无显著差异.如果受体缺乏，可使用土2朴受体.超过土24h的受体不润:1吏用.8.2胚胎移植技术8.2. 1胚胎移植季节:选在9月一it月份最为适宜。8.2.2受体移植所需器械、药品DB1I
17、3O1甲125-2001立体显微镜1:手术台1:剃须刀1:剪毛剪1:手术刀柄1:止血柑3-4:巾帕钳4:持针器I:手术刀片若千:缝合针:缝合线:创布若千:止血纱布若千:16#针头(尖端磨钝)1; fi 35m二培养器3-4:卡介苗注射器若千:针头式细菌涟路1-3; 5ml一次性注射器3-4;酒精，碘盯，新洁尔灭、生理盐水。液体石蜡、青链霉素。8.2.3受体移植操作步骤8.2.3. 1移植器的制作9-，.3.1.1将+介苗注射器洗净，烘干.8.2.3. 1.2拨出注射器内芯，将注射器管的前端在酒精灯上灼烧，拉制成长5cm-Bcm,直径I cm-1. 2mm的细管。冷却后用砂片将尖端断齐，再将芯播
18、入管内.注惹:借与芯是配套的不能搞混.8.2.3. 1.3将断齐的口端在酒精灯上小心烧结.使其回滑，但不能变形.即制成移植器。8.2.3. 1.4移植舒用后要立即用五燕水冲洗干净，高压燕气灭蔺或千热灭菌后再次使用。8.2.3.2受体母羊的手术法移植技术8. 2.3.2. 1.称生班.官:手术过程同于供体母羊冲胚手术。aZ.3.2.2胚胎的移植部位鲜胚采用物卯管移植:冻胚采用子宫移植。8.2.3.2.3吸取胚胎用移植公先吸一段1二长的保存液，再吸一段0. 5cm的空气.然后吸取胚胎.含胚胎的液柱不超过1.5cm.弓23.2.4愉卯营移植将具有负体一侧的物卯借伞部拨开.找到骨口，把装有胚胎的移植器
19、从此捅入3二一4cm.然后将胚胎轻轻推入物卵甘即可，8.2.3.2.5子宫移植将其有黄体一侧的子宫角取出，用尖端磨钝的1644针头在于官蟹上扎一孔，把装有胚胎的移植群从此孔描入子宫腔内，伸至子宫角尖端后将胚胎轻轻推出即可。注愈不要把移植修扎入子宫盈。无论物卵管移植还是子宫移植，移植液t限制在20 i+ 1以内.移植后要立即检查移植侣中是否有胚胎遗留。确认没有遗留后，才能进行创口缝合。8.2.3.2.9受体创口缝合:操作步砚同于供体羊手术。8.2.3.2.7按附最B做好受体移植记录.9妊服受体羊的饲养份理9. 1受体羊要加强饲养营理，趁免应激反应。9.2妊娠受体羊在产前2个月要补充足里的维生素、
20、微是元素，适当限制能量摄入，即要保证胎儿的正常发育，又要避免难产.9.3根据当地的疾病发生情况，有目的的注射一些疫苗，以防胎儿流产或传染病发生.DB1303rr 125-2001附录A(规范性附录)胚胎使用情祝记录表液氮魄._提漏号国产/进口冲胚时间_畜主供体耳号_._._品种注册号一精液编号_公畜注册号_冷冻日期_._、二1_抓处理:发情日_L. HRSH品牌(厂家)一批号一孕.处理一仁一日期FSH备注上午N下午PJ上午IU下午N上午IU下午Zf顶计发情日期_实际发情日期_人工授梢日期和次数第一次第二次第三次技术员_采胚:时间_一二一一黄体_渡泡回收-冷冻_移植获胚_桑相胚2一细胞胚_4一细
21、胞胚_8一细胞胚_一厂-道化未受粗卵_冷冻剂:甘油乙二醇玻瑞化(口一步法口二步法)评语:DB 1303厅123-2001附录日(规范性附录)供体羊采胚记录编号受体耳号品种及年龄移植地点发情时间移植时间冻胚鲜胚胚龄，质量、数量产羔情况备注审定结论2001年10月11日，由市质量技术监督局和市畜牧局组织有关专家组成的“农业标准”审定委员会，对桔秆饲料青贮技术操作规程).桔秆饲料氮化技术操作规程、桔秆饲料微贮技术操作规程、纬羊的胚胎移植技术规程进行了_认宾的评审.一致认为，绵羊胚胎移植技术是目前国际家畜繁殖的先进技术，对提高家畜的繁殖能力、快速推广优良品种、改普畜产品质it、提高经济效益将发挥极其重
22、要的推动作用.其余三个规程，技术先进，可操作性强，可充分利用当地自然资源，提高饲草利用率和家畜出栏率，改善畜产品质量，促进我市草食家畜的健康发展，不断提高生产水平，因此，同意发布实施.主任委员:(签字)副主任委员:(签字)眼湘衡属.剔魂百1落Al -7K压 -4置刚冲麟椒鹭娜枢麟框洛娜扭哪坦蟹娜.枢，平啊丽鹭铡日鹭彩日置困部哪坦瞩保毒认裸创碍蟹娜枢“崛本客娜扭篆恤郊枢娜枢甲扭八黛牟誉耸困冲娜枢娜扭部一枷一娜枷一y,4i娜邻I图锄娜洲州、0一、一00川四坏栖悟呢娜枢格啊娜枢格啊娜恤婚哎伽纠哭娜格嘴伽圳哭娜格啊娜枢格啊娜恤格呢娜枢格补砷一称哥珠哥一引令饰城锌一针令补发妞辞牡日裤写一军侧以袱壮礴一试碱胆叫呀叫砰屺喊你崛你H.!钢华t扮!田二L!i色辞坪咖喊你侧资.赞黛郊柳.廿工00Nus“ I us“你你喊称瞩粥军牛夕畔吧.称坦州咚-闪如一崛嘟也州裂一珠哥亦侧纯少贬、0!r、00!O*1
