1、 1 印行年月 94 年 10 月 本標準非經本局同意不得翻印 中華民國國家標準 CNS 總號 類號 ICS 67.160.20 N622612637經濟部標準檢驗局印行 公布日期 修訂公布日期 78 年 11 月 22 日 93 年 8 月 16 日 (共 3 頁 )水果及蔬菜汁飲料檢驗法 異檸檬酸之測定（酵素法） Method of test for fruit and vegetable juices and drinks Determination of isocitric acid by enzymatic analysis 1. 適用範圍：本標準規定水果及蔬菜汁飲料中異檸檬酸之檢驗
2、方法。 2. 檢驗方法：酵素法 ( Enzymatic analysis)。 2.1 裝置、器具及材料。 2.1.1 吸管；具刻度或微量吸管。 0.1 mL， 1 mL 及 2 mL。 2.1.2 比色管 1 cm 光徑，玻璃或塑膠。 2.1.3 分光光度計 (於 340 nm 下測定 )或光電比色計 (附汞燈者，於 365 或 334 nm下測定 )。 2.2 試藥： (所有試劑均以二次蒸餾水調配 )，活性碳、 4N 鹽酸溶液 (4 mol/L)、 4N 氫氧化鈉溶液 (4 mol/L)、 25 %氨水溶液、丙酮採用試藥級、 2.2.1 氯化鋇 (BaCl2)溶液：稱取氯化鋇 (BaCl2
3、2H2O) 30 g 溶解於水中並定容至100 mL。 2.2.2 硫酸鈉 (Na2SO4)溶液：稱取硫酸鈉 71 g 溶解於水中並定容至 100 mL。 2.2.3 硫酸錳 (MnSO4)溶液：稱取硫酸錳 (MnSO4 H2O) 125 mg 溶解於水 10 mL中，此溶液可保存於室溫至少 6 個月。 2.2.4 Tris-緩衝溶液溶液 (pH=7.0):稱取 Tris (Hydroxym ethyl) aminomethane 2.42 g 及 Ethylenediamine tetra-acetic acid disodium salt (dihydrate) EDTA Na2 2H2O
4、 35 mg 溶於水 80 mL，以 4N 鹽酸溶液調整至 pH7.0，然後以水定容至 100mL。此緩衝溶液於 4下可至少保存 1 年。 2.2.5 Tris-緩衝溶液溶液 (pH=7.4)稱取 Tris (Hydroxym ethyl) aminomethane 2.42 g 及 Ethylenediamine tetra-acetic acid disodium salt (dihydrate) EDTA Na2 2H2O 35 mg 溶於水 80 mL，以 4N 鹽酸溶液調整至 pH 7.4，然後以水定容至 100 mL。此緩衝溶液於 4下可至少保存 1 年。 2.2.6 NADP (
5、-nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate-disodium salt)溶液：稱取 -NADP Na2 50 mg 溶解於水 5 mL 中，此溶液於 4下可至少保存 4星期。 2.2.7 ICDH 酵素溶液： Isocitrate-dehydrogenase(ICDH)溶解於 50% Glycerol, ICDH之濃度為 10 mg/mL，約 20 U/mL。 2.3 試樣之製備 (1) 2.3.1 取果汁 10 mL 加 4N 氫氧化鈉溶液 5 mL 於 100mL 之離心管中，於室溫 (約20 )靜置 10 min，再加 4N 鹽酸溶液 5 m
6、L，然後稀釋至 25 mL。 2 CNS 12637, N 6226 2.3.2 加入氨水溶液 2 mL，氯化鋇溶液 3 mL 及丙酮 20 mL，以玻璃棒 混合均勻，放置 10 分鐘，再離心約 5 分鐘。 2.3.3 將上層液小心倒出，加入硫酸鈉溶液 20 mL 於沉澱物中，以玻璃棒攪拌，然後置於沸騰水浴中加熱 10 分鐘並不時攪拌，待冷卻至室溫 (約 20 )後，倒入 50 mL 容量瓶中並加入 Tris-緩衝溶液溶液 (pH 7.0)至標線，再倒入裝有活性碳 1 g 之燒杯中，放置 5 分鐘後以濾紙過濾，此無色濾液即為測試之樣品溶液。 註 (1) 若只測自由態之 D-isocitric
7、acid，可以不必經由樣品製備過程，直接由果汁中取樣即可。 2.4 步驟 光電比色槽 空白組 樣品組 硫酸錳溶液 (2.2.8) 0.10 mL 0.10 mL 緩衝溶液 (2.2.10) 3.00 mL 2.00 mL NADP 溶液 (2.2.11) 0.10 mL 0.10 mL 樣品溶液 1.00 mL 混合均勻，經 3 分鐘後測其樣品組及空白組之吸光值 (E1)，然後加入 酵素懸浮液 (ICDH)(2.2.12) 0.01 mL 0.01 mL 混合，經 5-10 分鐘 (2)反應完後測其樣品組及空白組之吸光值 (E2) 註 (2) 若 10 分鐘後反應仍未完全，每間隔 5 分鐘再讀
8、取吸光值，直至數據穩定為止，並計算總反應時間。 2.5 計算 E1000V1000FVM)L(mg/21= 異檸檬酸 E (E2 E1)樣品組 (E2 E1)空白組 M： -異檸檬酸的分子量 (192.1 g/mol) V1：在槽中的總液體量 (3.21 mL) V2：在槽中的樣品量 (1.00 mL) F：稀釋倍數 ：液槽之光徑距離 (1 cm) ： NADPH 的吸光係數 (Extinction coefficient) 340 nm 6.3/mmol cm Hg 365nm 3.5/mmol cm Hg 334nm 6.18/mmol cm 若所有的體積及量不變，則可以如下計算：E3083)L(mg/ 檸檬酸=異 3 CNS 12637, N 6226 相對應國際標準： IFU Method No.54, 1984, Determination of D-Isocitric acid (enzymatic) 修訂日期：第一次修訂： 80 年 6 月 25 日
