1、1 印月961月 本標準非經本局同意得翻印 中華民國國家標準 CNS 總號 號 ICS 67.100 N623412956經濟部標準檢驗局印 公布日期 修訂公布日期 811月17日 961月19日 (共6頁)乳品檢驗法食用乾酪檸檬酸含量之測定 Method of test for milk and milk products Determination of citric acid content in edible cheese 1. 適用範圍：本標準規定食用乾酪(包括再製乾酪)中檸檬酸含量之測定方法。 2. 檢驗方法：食用乾酪檸檬酸含量之測定，可採用比色法(colorimetric met
2、hod)或酵素法(enzymatic method)。如其結果發生紛歧時，以比色法(colorimetric method)為準。 2.1 比色法 2.1.1 原理：將乾酪均勻分散於水中，加入三氯醋酸(CCl3COOH)淨化後過濾，將淨化濾液以吡啶(pyridine)和醋酸酐(acetic anhydride)處理，並以分光光度計於428 nm測定試樣中無水檸檬酸之重量百分比。 2.1.2 裝置、器具及材料 2.1.2.1 分析天平：精確度至0.0001 g。 2.1.2.2 光電比色計或分光光度計：具有428 nm波長可供測定。 2.1.2.3 水浴機：可控制在(321)。 2.1.2.4
3、適當的研磨裝置。 2.1.2.5 試管：附玻璃或塑膠蓋者，16 mm或18 mm150 mm。 2.1.2.6 研棒與研缽：磁製，50 mL。 2.1.2.7 容量瓶：50，100及1000 mL。 2.1.2.8 吸管及滴定管。 2.1.2.9 玻璃漏斗：適當的大小。 2.1.2.10 濾紙：Whatman No.540或同級者。 2.1.3 試藥：使用試藥均需分析級試藥，使用水需為蒸餾水或同級純度以上者。 2.1.3.1 三氯醋酸溶液(1.836 M)：將三氯醋酸300 g溶於水中，定容至1000 mL。 2.1.3.2 吡啶。 2.1.3.3 醋酸酐(acetic anhydride)。
4、 2.1.3.4 檸檬酸鹽標準溶液(0.003252 M)：稱取檸檬酸鈉(C6H5O7Na32H2O)0.9565 g溶於水中再定容至1000 mL，此檸檬酸鹽標準溶液每L的溶液中應含有615 mg的無水檸檬酸。 2.1.4 步驟 2.1.4.1 試樣之製備 2.1.4.1.1 為使試樣更具代表性並顧及一般消費習慣，分析前削除乾酪外皮或易受污染之表層後，將試樣搗碎或使用適當方法將其均質化。為避免蒸發產生逸失，均質後需貯存在密閉的容器內直到2 CNS 12956, N 6234 分析，並在同一天內分析完畢。 2.1.4.1.2 精確稱取試樣0.5 g將其放在研缽中，加少量熱水(6070 )以研棒
5、碾碎使之均勻分散。 2.1.4.1.3 將研缽中的試樣移到100 mL的容量瓶中，使用之水量勿超過50 mL。 2.1.4.1.4 將容量瓶冷卻至室溫，加三氯醋酸溶液40 mL，旋轉方式混合之，以蒸餾水定容至100 mL，再次混合均勻。 2.1.4.1.5 室溫靜置30分鐘，然後用乾燥的濾紙過濾，丟棄最初的濾液，收集澄清透明濾液。任何試樣皆至少丟棄10 mL以上之初濾液。 2.1.4.2 測定：用吸管取澄淨的濾液1 mL至有蓋試管中，加吡啶1.3 mL，混合並立刻加入醋酸酐5.7 mL，蓋上塞子混合均勻後，立刻放入(321)水浴中，30分鐘後將試管取出，冷卻到室溫，拭乾，測其428 nm的吸光
6、值，並作空白試驗。此步驟須在30分鐘內完成。同一試樣需作2重覆。空白試驗測定方法同本法所規定，但不加入任何試樣。 2.1.4.3 檢量線之製備：取6個50 mL的容量瓶分別放入0、4、8、12、16和20 mL已製備好之檸檬酸鹽標準溶液，然後加入蒸餾水到約25 mL，加入三氯醋酸20 mL，旋轉混合。再用蒸餾水定容到50 mL，均勻混合，用吸管取稀釋標準溶液1 mL至有蓋的試管中。稀釋標準溶液內含有0，50，100，150，200，和250 g的無水檸檬酸。標準溶液經前述步驟處理。另以無水檸檬酸含量(單位為g)與其吸光值間的關係做標準曲線。 2.1.5 計算 2.1.5.1 將在第2.1.4.
7、2節步驟測得之試樣吸光值，以內插法由檢量線得到試樣中無水檸檬酸的量。 2.1.5.2 將試樣中無水檸檬酸含量以重量百分比來表示，其公式如下： 檸檬酸(%)=01m10000m D.F 式內，m0 =試樣重量(g) m1 =無水檸檬酸重量(g) D.F. = 試樣稀釋倍數。 2.1.5.3 重覆性：相同分析者之2重覆測定值，其無水檸檬酸含量的差別應不超過0.1/100 g。 2.2 酵素法 2.2.1 原理：利用酵素使檸檬酸轉變成草醋酸(oxaloacetate)與醋酸，再加入NADH使草醋酸還原，由於檸檬酸濃度會與NADH濃度之降低量成正比，再用分光光度計(波長340 nm)測定NADH濃度之
8、降低量。 2.2.2 裝置、器具及材料 2.2.2.1 分析天平：精確至0.0001 g。 3 CNS 12956, N 6234 2.2.2.2 pH測定儀(pH-Meter)：於25 之準確度在0.1 pH單位內。 2.2.2.3 玻璃燒杯：50 mL。 2.2.2.4 容量瓶1000 mL與100 mL。 2.2.2.5 濾紙直徑約15 cm。 2.2.2.6 分光光度計可測波長340 nm，配有光徑長度1 cm的塑膠、玻璃或石英光槽(cuvet)。 2.2.2.7 水浴溫度能維持於2025間。 備考：僅有在室溫低於20時才需將光槽置於水浴中培養。 2.2.3 試藥：除非特別說明，否則皆
9、使用分析級試劑，實驗用水應為蒸餾水或同級水，在製備酵素溶液時應使用二次蒸餾水。 2.2.3.1 三氯醋酸溶液：將三氯醋酸200 g溶於水中，以水稀釋至1000 mL，混合均勻。 2.2.3.2 氫氧化鈉溶液A, c(NaOH)=5.0 mol/L：稱取氫氧化鈉200.0 g溶於水，以水稀釋至1000 mL，混合均勻。 2.2.3.3 氫氧化鈉溶液B, c(NaOH)=1.0 mol/L：稱取氫氧化鈉40.0 g溶於水，以水稀釋至1000 mL，混合均勻。 2.2.3.4 氫氧化鈉溶液C, c(NaOH)=0.1 mol/L：稱取氫氧化鈉4.0 g溶於水，以水稀釋至1000 mL，混合均勻。 2
10、.2.3.5 氯化鋅溶液(ZnCl2)：稱取氯化鋅0.80 g溶於水，以水稀釋至1000 mL，混合均勻。 2.2.3.6 緩衝溶液，pH=7.8：稱取甘胺醯替甘胺酸(glycylglycine, H2NCH2CONHCH2CO2H) 71.3 g以水約700 mL溶解，以氫氧化鈉溶液A將pH調至7.8，加入氯化鋅溶液(2.2.3.5) 100 mL，再以水定容至1000 mL，混合均勻，將此溶液儲存於08，可保存4週。 2.2.3.7 碳酸氫鈉(NaHCO3)：稱取碳酸氫鈉4.0 g溶於水，以水稀釋至1000 mL，混合均勻。 2.2.3.8 菸鹼氨嘌腺呤二苷酸之還原態溶液(reduced
11、nicotinamide-adenine dinucleotide)：溶解菸鹼氨嘌腺呤二苷酸二鈉鹽之還原態(C21H27N7O14P2Na2) 50 mg與碳酸氫鈉(第2.2.3.7節)100 mg於水10 mL中。將此溶液儲存於08 間，可保存4週。 2.2.3.9 硫酸銨(ammonium sulfate)溶液, c(NH4)2SO4=3.2 mol/L：稱取硫酸銨422.4 g溶於水，以水定容至1000 mL，混合均勻。 2.2.3.10 蘋果酸去氫酶/乳酸去氫酶懸浮液(malate dehydrogenase/lactate dehydrogenase suspension)：將足量的
12、蘋果酸去氫酶MDH，EC 1.1.1.37，來自豬心(Pig heart)，pH值約為6之硫酸銨溶液(第2.2.3.9節)懸浮液與乳酸去氫酶LDH，EC 1.1.1.27，來自兔子肌肉(rabbit muscle)，pH值約為7之硫酸銨溶液(第2.2.3.9節)懸浮液；pH值約為7；EC 1.1.1.27混合，再以硫酸銨溶液稀釋，以得到每mL約含4 CNS 12956, N 6234 600單位MDH與1400單位LDH之懸浮液。將此溶液儲存於08間，可保存1年。 2.2.3.11 檸檬酸解離酶溶液(citrate lyase solution)：溶解足量的檸檬酸解離酶CL，EC 4.1.3.
13、6，來自產氣桿菌(Aerobacter aerogenes)於冰水中，製備每mL含40單位Cl之溶液，將此溶液儲存於08間，可保存1週，儲存於20，可保存4週。 2.2.3.12 檸檬酸標準溶液：稱取單水合檸檬酸(C6H8O7H2O) 1.600 g溶於水，以水稀釋至1000 mL，混合均勻。 備考1. 若所用的酵素懸浮液之活性與本標準中所描述的不同，則吸量表(第2.2.5.4.1節)中所使用的酵素懸浮液之體積應成比例地增加或減少。 2. 第2.2.3.5節至第2.2.3.12節中所使用的試劑亦可由商業販售之試驗組合獲得。 2.2.4 試樣之製備：以下列步驟製備均勻的試樣，且在均質過程需特別注
14、意避免水分的漏失。 2.2.4.1 乾酪：除去乾酪的表層、污跡或發黴層，經適當的研磨裝置磨碎，快速混合，若可能的話再研磨第二次，並再次以強力的攪拌及揉捏使試樣徹底混合均勻。 2.2.4.2 加工乾酪：取出試樣之具代表性部分，將使用適當的裝置將試樣快速混合及攪拌，若有需要可再以強力的攪拌及揉捏使試樣徹底混勻。 2.2.4.3 含其他食品碎片(如火腿、水果、堅果或藥草等)之加工乾酪：先決定分析之目的是僅測定加工乾酪之檸檬酸含量或測定完整產品之檸檬酸含量，若為完整產品則採步驟(第2.2.4.2節)加工乾酪之方式，若為前者則先將其他食品碎片分離後再以步驟(第2.2.4.2節)加工乾酪之方式進行。試樣製
15、備完後，將試樣移至一附不透氣蓋之容器內儲存直到分析，在試樣製備完後儘快進行分析。 2.2.5 步驟 2.2.5.1 精確稱取製備試樣1 g或更多於燒杯中。 2.2.5.2 空白試驗：依第2.2.5.3節及第2.2.5.4節進行空白試驗，使用所有試劑但不加試樣。 2.2.5.3 懸浮溶液製備以及去蛋白 2.2.5.3.1 使試樣懸浮於50 mL溫水(4050 )中，再將其移入100 mL容量瓶，冷卻至約20。 2.2.5.3.2 加入10 mL三氯醋酸溶液於懸浮液體中，再以水定容至標線，徹底混勻，靜置30分鐘，在進行過濾前不要再次混合容量瓶之內容物。 2.2.5.3.3 以濾紙過濾上澄液，將一開
16、始的濾液部分丟棄。 2.2.5.3.4 吸取25 mL過濾液於燒杯中並以氫氧化鈉溶液B將pH調至約5 CNS 12956, N 6234 為4，再以氫氧化鈉溶液C將pH調至約為8，將燒杯內容物移至100 mL定容瓶，以水定容至標線後混合均勻。 2.2.5.3.5 以濾紙過濾，將一開始的濾液部分丟棄。 2.2.5.4 測定：根據下表進行測定，在使用前須將緩衝溶液及水回溫至室溫。 2.2.5.4.1 將下表各試劑吸取至分光光度計光槽 試樣之測定 空白試驗 緩衝溶液(第2.2.3.6節) 1.00 mL 1.00 mL NADH溶液(第2.2.3.8節) 0.10 mL 0.10 mL MDH/LD
17、H懸浮液(第2.2.3.10節) 0.02 mL 0.02 mL 試樣或標準品的濾液 2.00 mL 空白試驗的濾液 2.00 mL 2.2.5.4.2 混合光槽中的內容物，置於溫度2025間之水浴培養5分鐘，以空氣為背景值，以分光光度計測定每個光槽中的溶液在340 nm的吸光值(A0)。 2.2.5.4.3 加入檸檬酸解離酶0.02 mL，混合光槽中的內容物，並將其置於溫度2025間之水浴培養10分鐘，以空氣為背景值，測定每個光槽中的溶液的吸光值(A10)。 2.2.5.4.4 依方程式(1)計算出每一光槽之吸光值，進而依方程式(2)計算出檸檬酸含量： A = A0 A1 0 (1) 其中，
18、A0：在加入檸檬酸解離酶前所測得的吸光值； A10：在加入檸檬酸解離酶並培養10分鐘後所測得吸光值。 2.2.5.4.5 假使吸光值降低量超過0.800，則適當地稀釋濾液後再重覆進行第2.2.5.4節步驟。 2.2.6 計算：試樣之檸檬酸含量w，依方程式(2)計算，以無水檸檬酸之重量百分比表示 W%100VVVVVVVKlMM)AA(6742531rs%VVm)AA(915.167rs(2) 式內，As：試樣所得的的吸光值； Ar：空白試驗所得的平均吸光值。 M：檸檬酸的莫爾質量(無水檸檬酸，M = 192.1 g/mol)。 K：NADPH在波長340 nm的莫爾吸光係數(即6.3106 c
19、m2/mol)。 l：分光光度計光槽的光徑長度(l1 cm)計。 m：試樣(第2.2.5.1節)重量，以g計。 V1：分光光度計光槽中液體的總體積(V13.14 mL)。 V2：加入分光光度計光槽中吸取濾液(第2.2.5.3.5節)的體積(V22.00 mL)。 6 CNS 12956, N 6234 V3：去蛋白過濾液在調整至pH 8後被稀釋(第2.2.5.3.4節)之體積，(V3 100 mL)。 V4：去蛋白過濾液調整至pH8時吸取的體積(第2.2.5.3.4節)，(V425 mL)。 V5：第2.2.5.3.2節中所製備溶液的體積(V5100 mL)。 V6：吸取濾液(第2.2.5.3.5節)作稀釋(第2.2.5.4.5節)之體積，以mL計。 V7：測試溶液(第2.2.5.3.5節)被稀釋(第2.2.5.4.5節)之最終體積，以mL計。 相對應國際標準：ISO 2963, 1997, Cheese and processed cheese products Determination of citric acid content Enzymatic method. AOAC 976.15,2003, Citric Acid in Cheese.
