1、 1 印行年月 94 年 10 月 本標準非經本局同意不得翻印 中華民國國家標準 CNS 總號 類號 ICS 11.040.70 T5013-10 14393-10經濟部標準檢驗局印行 公布日期 修訂公布日期 94 年 3 月 25 日 年月日 (共 52 頁 )醫療器材生物性評估第 10 部：刺激性及延遲型過敏性測試 Biological evaluation of medical devices- Part 10： Tests for irritation and delayed-type hypersensitivity 1. 適用範圍：本標準規定醫療器材及其組成材料潛在產生刺激及延遲過
2、敏反應之評估程序，包括： (a) 測試前之考量 (b) 詳細之試驗步驟 (c) 詮釋結果之主要參數 備考 1. 附錄 A 特別針對與上述測試方法相關之材料製備，提供指導。 2. 附錄 B 提供特別針對以皮內方式應用於眼、口、直腸、陰莖、及陰道等部位之器材，所可能被要求之補充測試方法。 2. 用語釋義：本標準之用語除依據 CNS 14393-1醫療器材生物性評估第 1 部：評估與試驗之規定外，另作下述之定義。 2.1 過敏原 (allergen/sensitizer)：指可經由先前之曝露而引發後續接觸時，特定過敏反應之物質與（或）材料。 2.2 空白試液 (blank liquid)：與試樣製備
3、用相同成分，且經相同程序處理，但不含測試材料之溶劑。用以測定溶劑所可能造成的背景反應。 2.3 考驗 /誘出 (challenge/elicitation)：指經過誘發階段 後，經由後續之曝露，檢測材料之個體免疫反應之程序。 2.4 腐蝕 (corrosion)：組織中結構或物質的緩慢破壞。例如：強烈刺激物之作用。 2.5 延遲型過敏性反應 (delayed-type hypersensitization)：指個體因曝露於過敏原而誘發 T 細胞調控之免疫記憶，當再次曝露於過敏原時，所造成之延後發生之過敏反應。 2.6 劑量 (dose)：單次測試時施加於測試系統之量。 2.7 紅斑 (eryt
4、hema)：皮膚與（或）黏膜之發紅現象。 2.8 痂 (eschar)：皮膚之結痂或變色腐離。 2.9 誘發 (induction)：個體對於特定材料新發展出一個不同的免疫反應狀態的過程。 2.10 刺激物 (irritant)：會造成刺激反應之物質。 2.11 刺激性 (irritation)：由於單次、重複或連續使用待測材料與（或）材料所造成的局部非特異性發炎反應。 2.12 壞死 (necrosis)：單一或多量細胞、局部組織或器官之壞死導致不可回復之損傷。 2.13 陰性對照組 (negative control)：根據本標準所示程序進行測試，顯示可得到具 2 CNS 14393-10
5、, T 5013-10 2.14 水腫 (oedema)：組織因不正常之液體滲入所造成的腫脹。 2.15 陽性對照組 (positive control)：根據本標準所示程序進行測試，顯示可得到具有再現性及適當之陽性或具反應性之對照物質或材料。 2.16 溶劑 (solvent)：用來潤溼、稀釋、懸浮、萃取或溶解待測物質之物質與（或）材料。例如：化學品、溶媒等。 2.17 測試材料 (test material)：被取樣做為生物或化學試驗之材料、裝置、部分裝置或元件。 2.18 試樣 (test sample)：用來進行生物或化學試驗之部分測試材料或其萃取物。 2.19 潰瘍 (ulcerat
6、ion)：表層組織喪失之開放性瘡口 3. 逐步評估之通則 現有之刺激性與過敏性測試方法為特別針對偵測對皮膚潛在之刺激性與過敏性所建立。一般而言，這些測試方法無法用於預測其他型態之不良反應。 本標準以逐步方式進行評估，須包含下列之單一或多項步驟： (1) 測試材料之定性，根據 CNS 14393-9醫療器材生物性評估第 9 部：潛在降解產物之鑑定及定量分析架構及 ISO 10993 中之第 13、 14、 15 及 18 部分標準，進行試樣之化學特性及分析； (2) 文獻回顧。包括化學與物理性質評估及搜集與產品組成或結構相關之化學物或材料之刺激與過敏性資訊； (3) 體外試驗應較體內試驗優先被考
7、慮施行。 當新確認可行之體外試驗方法成立時，應以之取代體內試 驗。目前 (除簡單篩選外 )尚未有任何經確認有效之體外試驗方法，可用以偵測刺激性或過敏性物質； (4) 動物體內試驗； 備考：對於在步驟 (1)或 (2)中，未被歸類為嚴重刺激物或強烈過敏原之材料，進行動物活體內急性反應試驗。對於單次曝露未呈現急性皮膚刺激反應之材料，可進一步以重複曝露方式評估。 檢驗實驗室至少每六個月須進行皮膚過敏性之陽性對照組測試，證實其陽性反應以確效測試系統。 (5) 非侵入式人體試驗與（或）臨床試驗 若材料已被證實為非刺激物、過敏原及在動物體內無毒性，則可考慮於人體進行皮膚刺激反應測試。 4. 測試前之考量
8、4.1 通則 首先需強調，測試前之考量可能會導致不需進行刺激性或過敏性測試之結論。在 CNS 14393-1 之第 4 節及下列各節適用。 4.2 材料類型 4.2.1 初步考量 須考慮到醫療器材在製造或組裝過程，可能添加額外之化學成分 (如潤滑劑或脫模劑 )以做為製程輔助用。除初始材料及製程輔助劑之化學成分外，組 3 CNS 14393-10, T 5013-10 裝過程之接著劑與（或）殘餘 溶劑，以及殘餘殺菌劑或滅菌過程導致之反應產物，有可能出現於最終產品中。這些成分是否會造成健康之危害與 （或）危險，取決於最終產品之滲漏或降解特性。 4.2.2 陶瓷、金屬與合金 這些材料之化合物組成數目
9、通常不若高分子或生物衍生材料複雜。 4.2.3 高分子 這類材料之化合物組成通常較第 4.2.2 節之材料組成複雜，可能存在許多添加物，且高分子之聚合度亦可能不同。 4.2.4 生物衍生材料 這類材料原本即具有複雜之組 成，亦經常含有製程殘留物，如交聯劑與抗菌劑等。每個生物材料樣品之性質可能並不完全一致。 本標準之測試法並非為測試生 物衍生材料所設計，因此可能較不適用。例如：本標準之測試法並未考慮不同種動物間之過敏性。 4.3 化學成分資訊 4.3.1 通則 須建立材料完整之化合物組成 之定性資料。對於生物安全性重要者，則須取得量化數據。若未取得量化數據，須闡述並記錄合理之理由。 4.3.2
10、現有資料來源 定性及定量之組成成分資訊，可能由初始材料供應商處取得。 對高分子材料而言，此經常需 取得具智慧財產權之資訊，須訂定必要之條款，以便使用或傳遞此機密資訊。 製程中之添加劑 (如脫膜劑 )之定性資訊，亦須由製程中連鎖製造商之適當成員處取得。 若缺少相關組成之資料，建議 由文獻研究，建構出可能之初始材料與添加物特質，以便協助選擇最適當之材料分析方法。 備考： 陶瓷、金屬與合金材料之組成可依據 ISO 或 ASTM 之規範與（或）由使用者 指定。然而為了取得組成之完整詳細之定性與定量資料，可能需要求初始材料供應或製造商，以及元件製造商 提供這些資料，以便確保製程輔助劑亦相同。由管理當局持
11、有之材料原始檔案，亦為另一個可以取得資料之來源。 4.4 材料特性分析 當缺乏詳細之成分資料或僅能取得定性之資料，或預期在製程中可能產生新或未知的物質時，可能須對材料進行分析。 須對檢測材料採用適當之分析方法。所有分析技術均須具適用性與確效且提出報告，若尚未知材料（化學溶液）之 pH 值，則在可能情況下，須於體外或體內測試前先行量測其值。萃取物之化學成分分析（定性及定量）可能提供有用之資訊，因此若萃取物之化學分析結果所得知之萃取液成分，其刺激及過敏性資料已可取得時，亦可能不需進行刺激及過敏性測試。 4 CNS 14393-10, T 5013-10 5. 刺激性試驗 5.1 體外刺激性試驗 在
12、國際間已有兩項體外試驗：大鼠之皮 膚經皮電阻 (Transcutaneous Electrical Resistance, TER) 試驗及 EPISKIN 試驗，被確效可作為化學物之皮膚腐蝕性試驗之替代方法；然而對於皮膚刺激性之評估，則尚未有經確效之方法。 國家及國際組織持續致力於發展或確效可行之替代性體外試驗方法，同時致力於發展可量化評估動物或人體反應之方法，以便能更好的定義出使用非侵入技術評估之終點。 (參見附錄 C.1) 5.2 設計及選擇體內試驗方法時之考量因素 醫療器材之刺激性測試可針對最終產品與 (或 )其萃取物進行。 影響刺激性研究結果之因素包括： (a) 貼片測試中使用器材之
13、性質； (b) 測試材料之劑量； (c) 測試材料施加之方式 (d) 密閉之程度； (e) 施加之部位； (f) 曝露時間之長短與次數；及 (g) 評估試驗之技術。 其餘背景資訊參見附錄 C. 雖然增加規範之彈性，可容許研究者提 高測試反映使用及曝露狀況之靈敏程度；然而一致之試驗步驟，則有助於不同材料在不同實驗室間測試結果之相互比較。 試驗步驟中亦包括了對於具有重複與（或）長期曝露狀況之器材或材料之評估規範。 研究者在諮詢製造商後，研究中設計之接觸時間與（或）濃度，須超過臨床上預期之接觸程度。唯在詮釋實驗結果時，仍須將此實驗條件列入考量。 當試樣之 pH 值 2 或 11.5 時，須宣告為刺激
14、性物質而不 須再進行其他試驗。然而實驗證據顯示，測試材料之酸鹼性並非決定其可能造成嚴重傷害之唯一因素。測試材料之濃度、接觸時間長短以及其他材料之物理及化學性質亦是重要因素。 備考： 對於預定被大量應用在正常或受損皮膚上之產品，一般而言，任何實質上之風險均不可接受；唯許多產品雖然有造成刺激性之可能，然而因其使用之利大於弊或考量其所預期之生物活性，仍然是可接受的。 5.3 動物皮膚刺激試驗 5.3.1 原理 在一適切的動物模型上，評估 材料在試驗條件下產生皮膚刺激之可能性。兔子為較佳之測試動物。 5.3.2 測試材料 5 CNS 14393-10, T 5013-10 若測試材料為固狀或液狀須依附
15、錄 A 方式製備。 為顯示評估之靈敏度，每隻動 物除陰性對照組外，建議亦應包括陽性對照組。由於每隻動物上有兩個測 試部位及兩個對照實驗部位，因此若使用相同溶媒，則每隻動物最多可施加兩個測試材料。 5.3.3 動物及管理 需使用體重 2kg 以上單一品系之健康成年白化之雄兔或雌兔。 這些實驗動物須依據 CNS 14393-2醫療器材生物性評估第 2 部：動物福利之規定之準則加以照顧，使之適應。 若預期會有刺激性反應，須考 慮先使用一隻動物進行測試。除非觀察到明確之陽性反應紅斑或水腫評分大於 2(參見表 1)，否則至少須再使用兩隻動物進行試驗。若預期不會 有刺激性反應，可以使用三隻動物進行初試驗。
16、若使用至少三隻動物之試 驗結果，其反應仍是模稜兩可或難以確認，則須考慮進行額外的試驗。 5.3.4 試驗步驟 5.3.4.1 動物之準備 動物的皮膚狀態為關鍵因素，只使用具健康完備皮膚之動物。通常在測試前之 24 h 至 4 h 間，剃除動物背脊兩側足夠範圍之毛，以做為所有試驗部位之施加與觀察用（約 10x 15cm） 。為因應重複曝露試驗時，施加與觀察之需求，可對實驗動物重複剃毛。若針對所採用之檢測設施，已確效其操作程序，可由經訓練之技術員以脫毛劑除毛。若需進行重複曝露試驗，則依照本標準中第 5.3.4.2 節、第 5.3.4.3 節或第5.3.4.4 節之程序，重複最多達 21 天之試驗。
17、 圖 1 皮膚施加位置示預定 說明： 1.頭端 5.對照組部位 2.測試部位 6.測試部位 3.對照組部位 7.尾端 4.剃毛之背部 尾端 21 3 521 12 647 6 CNS 14393-10, T 5013-10 5.3.4.2 粉末或液體樣品之施加 將 0.5g 或 0.5mL 之測試材料直接施加於如圖 1 所示之皮膚測試部位上。塊狀及疏水性材料，施加前不需先行潤溼。若為粉末狀物質，應在施加前，先以水或其它適當之溶劑將之輕微潤溼。 (參見附錄 A)將施加部位以一 2.52.5 cm 非密閉性之敷料（如 吸收性紗布片）覆蓋，再將之以繃帶 (密閉或半密閉性 )包紮至少 4 h。在到達預
18、定之接觸時間後，移除敷料，將測試部位以永久性墨水標記。將殘餘之測試材料以適當之方式去除，例如以溫水或其他適當、無刺激性之溶劑清洗，然後小心乾燥。 5.3.4.3 萃取液及萃取溶媒之施加 將適當之萃取液置於一 2.52.5cm 之吸收紗布片上。萃取液之體積以剛好夠使紗布飽和吸收為原則（通常約每片 0.5 mL）。將測試材料試樣萃取液潤溼之紗布，每側一片施加於動物背部 (如圖 1 所示 )。施加由萃取溶媒潤溼之紗布片於對照組部位 (如圖 1 所示 )。 以繃帶 (密閉或半密閉性 )包紮至少 4 h。在到達預定之接觸時間後，移除敷料，將測試部位以永久性墨水標記。將殘餘之試樣以適當之方式去除，例如以溫
19、水或其他適當、無刺激性之溶劑清洗，然後小心乾燥。 5.3.4.4 固體樣品之施加 如圖 1 所示，將測試材料直接施加於每隻兔子皮膚兩側之測試部位上。相同地，在每隻兔子上施加對照組。對於固體樣品（若需要，可將之磨成粉末），須將之以水（或必要時，以其他選擇之適當溶劑）加以潤溼，以確保與皮膚之良好接觸 (參考附錄 A)。若使用溶劑，則須考慮溶劑在皮膚刺激性試驗所可能造成的影響。 將施加部位以一 2.52.5cm 非密閉性之敷料（例如紗布片）覆蓋，再將之以繃帶 (密閉或半密閉性 )包紮至少 4 h。在到達預定之接觸時間後，移除敷料，將測試部位以永久性墨水標記。將殘餘之試樣以適當之方式去除，例如以溫水或
20、其他適當、無刺激性之溶劑清洗。最後小心乾燥。 5.3.5 動物觀察 5.3.5.1 通則 建議儘可能使用自然光或全光譜光源進行皮膚反應之觀察。針對每個測試部位在每個間隔時間點描述其紅斑及水腫狀況，並根據表 1 之歸類系統加以評分，記錄結果作為測試報告用。 備考：組織學之技術或非侵入式技術在某些情況下，可用以輔助皮膚反應之評估。 5.3.5.2 單次曝露試驗 對於單次曝露試驗，移除貼片後，經 1 h、 24 h、 48 h 及 72h，記錄每個測試部位之外觀。若出現持續性損傷，則可能需延長觀察時間，以 7 CNS 14393-10, T 5013-10 評估其損傷是否為可回復性。此觀察不需超過
21、14 天。 5.3.5.3 重複曝露試驗 重複曝露試驗只有當完成急性單次曝露試驗 (經過至少 72 h 之觀察 ) 後才進行。 對於重複曝露試驗，在每次移除貼片 1 h 後及進行下一試驗前立即記錄其外觀。 曝露之次數可能不同。 在最後一次曝露後，於移除貼片後，經 1 h、 24 h、 48 h 及 72 h，記錄每個測試部位之外觀。若出現持續性損傷，則可能需延長觀察時間，以評估其損傷是否為可回復性。此觀察不需超過 14 天。 表 1 皮膚反應之評分系統 反 應 主要刺激評分數值紅斑及痂之生成 無紅斑 非常輕微之紅斑 (幾乎無法察覺之程度 ) 清晰之紅斑 中度之紅斑 重度紅斑 (甜菜紅 ) 至形
22、成痂以 致無法評估紅斑之程度 0 1 2 3 4 水腫之生成 無水腫 非常輕微之水腫 (幾乎無法察覺之程度 ) 清晰之水腫 (部位之邊緣有清晰之隆起 ) 中度之水腫（突起約 1mm高） 重度水腫 (突起超過 1mm高且面積大於曝露區域 ) 0 1 2 3 4 最大可能刺激評分 8 備考：皮膚上出現其他之不良變化，均須記錄且報告。 5.3.6 結果評估 對於單次曝露試驗， 以下列方法決定其主要刺激指數 (Primary Irritation Index, PII)： 僅以 24 h、 48 h 及 72 h 觀察之結果評分。在施加樣品前或移除樣品後 72 h 以上，用來監測其恢復狀況之 觀察結果
23、，均不用以做為主要刺激指數之評分。對每隻動物，將測試材料 在特定時間點測得之紅斑及水腫狀況之主要刺激評分值相加，並除以觀測之總數 (一次觀察同時包括了每個測試部位之紅斑及水腫 )。當使用空白試液或陰性對照組時，計算對照組之主要刺激評 8 CNS 14393-10, T 5013-10 分值，並將之由測試材料之主 要刺激評分值中扣除，即可得實際測試材料之主要刺激評分值。將對每隻 動物測得之主要刺激評分值相加後，除以動物總數，即為主要刺激指數 (PII)。 對於重複曝露試驗，以下列方法決定其累加刺激指數 (Cumulative Irritation Index)： 對每隻動物，將在每個特定時 間點
24、測得之紅斑及水腫狀況之主要刺激評分值相加，並除以觀測之總數，可得每隻動物之刺激評分值。 將所有動物測得之刺激評分值相加後，除以動物總數，即為累加刺激指數。 所得之累加刺激指數可參見表 2 之定義，評估其刺激反應等級，並做為報告之記錄。 備考 ： 累加刺激指數之分類，乃根據以 若干化學品同時對兔子及人體進行試驗，所建立之兔子之 PII 值與人體之主要刺激反應相關性之實驗數據。 對試驗中之任何反應，根據表 1，記錄每隻動物之最大主要刺激評分值，以及產生反應的時間啟動與達到最大反應的時間。 主要或累加刺激指數之特性由表 2 中之數值 (評分 )及敘述 (反應分類 )界定。 若測試不同之萃取液，則以最
25、高之 PII 決定表 2 中之反應分類。 表 2 兔子試驗之刺激反應分類 平均評分 反應分類 0 0.4 0.5 1.9 2.0 4.9 5.0 8.0 可忽略 輕微 中度 嚴重 5.3.7 測試報告 測試報告須包括： (a) 對測試材料或器材之描述； (b) 測試材料或器材預定用途與（或）應用； (c) 測試材料或試樣製備方法之詳細描述； (d) 對實驗動物之描述； (e) 施加於測試部位之方法與使用之繃帶材料形式 (密閉或半密閉性 )； (f) 測試部位如何標記及反應如何讀取； (g) 記錄觀察之結果； (h) 重複曝露試驗須記錄曝露次數及每次曝露之間隔時間； (i) 結果評估。 5.4
26、人體皮膚刺激試驗 5.4.1 前言 9 CNS 14393-10, T 5013-10 目前在以預測其對人體皮膚刺 激性確認有害物質方面，主要依賴實驗動物之使用 (參見附錄 C)。然而由動物實驗之結果來推論人體反應，仍有其問題存在。因此對於若干 人體高度曝露之化學品 (諸如化粧品、清潔劑 )，其危險評估經常是以人體皮膚之貼片試驗進行。 人體試驗可達到下列幾項目的： (a) 直接由人體試驗而非由試驗動物確認化學品對人體之傷害； (b) 對於若干人體高度曝露之化學品，提供危險評估； (c) 有助於先前之動物實驗結果延伸應用於人體。 本標準允許直接由人體取得皮 膚刺激性數據，以確認有害物質。其目的在
27、決定一個物質經急性曝露後，是否會造成顯著的皮膚刺激性傷害。 臨床試驗須依據 ISO 14155-1 及 ISO 14155-2 規範進行。 備考：附錄 C.1 提供進一步之刺激性測試資訊。 5.4.2 初始考量 須提供測試材料以及 (當有必要時 )其組成化合物之適當毒性資料，其中包括表皮吸收之數據，以顯示試驗不會造成任何顯著的健康危險。 材料不得於人體進行測試，若： (a) 在先期之體內或體外試驗中，已顯示為刺激性物質， (b) 在先期之體內或體外試驗中，已顯示為腐蝕性物質， (c) 據物質之結構、活性與 (或 )物理化學性質，例如強酸或強鹼，可預期其對人體皮膚具有潛在之腐蝕性， (d) 顯示
28、對皮膚或呼吸道具有過敏性危險， (e) 在測試狀況下出現任何急性毒性危害，與 (或 ) (f) 呈現任何基因毒性、生殖或致癌危害。 自願測試者之選擇，參見本標準第 5.4.4.1 節及附錄 C.1 節。 5.4.3 原理 單一劑測試材料以密閉方式施 加於自願測試者之皮膚。經由測試材料在短時間內之施用，以維持刺激在 最低之程度。在某些情況下，亦可進行較長時間之曝露試驗。 主要評估方法依據自願測試者 對一反應產生皮膚刺激，相對於並行之陽性對照組產生皮膚刺激之比例來決定。 5.4.4 試驗方法 5.4.4.1 自願測試者之選取 本標準乃為使用健康之自願測試者而設計。選取之自願測試者至少須年滿十八歲、
29、且未懷孕或未授乳。自願者若已知對測試材料敏感或顯示任何皮膚發炎跡象，則須被排除進行試驗。自願測試者之選取須在皮膚科醫師或其它具資格人員之監督下進行。 5.4.4.2 試劑之準備 液體測試材料通常未經稀釋使用。對於固體樣品，以少量水 (通常為 10 CNS 14393-10, T 5013-10 0.2 mL)或必要時以其他適當之溶媒潤溼， 以確保與皮膚之良好接觸。固體之結構須被考量，且選用適當之測試材料製備方法。使用潤溼之樣品時，須確保每個測試對象接受到等量的測試材料。每個試樣均應以等量之水潤溼，並記錄其量。 當使用溶媒時，則須將溶媒對皮膚刺激所可能造成的影響列入考慮。若使用水以外之溶媒作為固
30、體化合物之潤溼劑，則須考慮對每個測試對象，施加空白試液貼片 (溶媒對照組 )。 5.4.4.3 試驗步驟 5.4.4.3.1 自願測試人數 至少須有 30 位自願測試者完成測試，其中男性或女性人數均不得少於受測總人數之三分之一。 5.4.4.3.2 測試材料之施加 以密閉性之紗布貼片將測試材料施加於適當部位 (例如上臂外側 )之完整皮膚上。所有自願測試者之施加部位均須相同且加以記錄。一般而言，貼片直徑尺寸最好是 2.5 cm 或至少大於1.8 cm。在曝露期間，貼片應以無刺激性之敷料，包括無刺激性之膠帶，固定接觸於皮膚上。 貼片須施加適當之劑量：通常約 50 至 100 mg/cm2測試材料，
31、被視為最適劑量。對於液態測試材料，通常施加 0.2 至 0.4 mL，直到紗布貼片潤溼。對於固體，通常將 0.2 g 測試材料潤溼後再施加於紗布貼片。 另一種固體試樣施加方式為，將整個測試部位施加測試材料後，以潤濕之紗布貼片覆蓋。 5.4.4.3.3 曝露時間 為避免不可接受之強烈反應，須採用謹慎方式進行測試。連串性之貼片測試可允許建立起一陽性、但不嚴重的刺激反應。貼片以漸進方式，將曝露時間由 15 及 30min 起，逐漸增加至 1 h、2 h、 3 h、及 4 h。 若有足夠證據顯示經過 1h 之曝露不會造成過度之反應，則可省略 15 與 (或 )30 min 之測試。是否在一個新的皮膚部
32、位，進行較長時間 (包括 24 h)之密閉性貼片曝露測試，取決於短時間之曝露測試，未出現皮膚刺激反應 (至少評估 48 h)，以確保延遲型刺激反應被適當之評估。 較長時間之曝露測試皆施加材料須於先前未處置之部位。 曝露測試結束時，殘餘之測試材料須以水或適當溶劑移除，而不改變存在之反應或表皮之完整性。 5.4.4.3.4 曝露之限制 除了以第 5.4.4.3.3 節所述之方式，階段式的增加 曝露時間外， 11 CNS 14393-10, T 5013-10 若懷疑測試材料可能造成嚴重的刺激，則須大幅度降低曝露時間。可能的話，應進行先期自願群測試。正式試驗之進程，遂可依據所得之數據來決定。後續之貼
33、片僅在 48/72h 後判讀，才可施加。 5.4.4.3.5 臨床觀察及皮膚刺激反應評分 處置之部位在移除貼片後，於零時間、 1 h 至 2 h、 24 h、 48 h及 72 h，檢查其刺激之徵兆並對其反應進行評分。若需決定其反應之可回復性，則觀察時間可延長超過 72h。此外，測試前後的皮膚狀況 (諸如：色素沈著、含水程度 )，須被詳細描述。皮膚刺激反應依據表 3 加以評分記錄。 表 3 人體皮膚刺激試驗之評分等級 反應之描述 評分等級 無反應 0 輕度陽性反應 (通常由溫和之紅斑與 (或 )大部分處置部位之乾燥來界定 ) 1 中度陽性反應 (通常呈明顯之紅斑或乾燥，範圍可能超出處置部位 )
34、 2 重度陽性反應 (強烈且往往擴散之紅斑，伴隨水腫與(或 )痂之生成 ) 3 自願測試者在曝露時間小於 4 h 的試驗中，若評分等於或大於1，則他們將被假設在曝露 4 h 的試驗中，會對測試材料試樣呈現更強烈的反應。一旦自願測試者出現等於或大於 1 之評分，則不需對該測試者進一步之材料曝露試驗。唯須進一步觀察，以便對自願測試者提供適當之照顧。除了刺激反應之觀察外，其它任何影響均應被詳細描述與記錄。諸如： 測試者應被訓練對相關於貼片施用加表達意見 (例如感覺效應 )，而評估者則須被訓練可察覺到貼片移除後之立即反應 (例如蕁麻疹 )。這樣的反應可能並非顯示為刺激效應， 但若察覺，則須將之包括在報
35、告中。若為顯著之反應，則須在研究之管理中被考慮到，以確保自願測試者之適當照顧。 關鍵之數據為經過長達 4 h 之曝露後，自願測試者具體有、或預期將會有皮膚刺激反應的人數。個體顯現反應 (若有的話 )所需時間與用來被評估之結果無關，它只牽涉到自願測試者適當照顧之確保。 5.4.4.3.6 並行之陽性對照組物質之基本原理與選擇 由於人體對刺激物之反應顯示差異性，因此在試驗中須包含陽性對照組，以確保測試組員作為檢測試樣之刺激性的適當性。 12 CNS 14393-10, T 5013-10 濃度 20 %之十二烷基磺酸鈉 (sodium dodecyl sulfate, SDS)由於其刺激作用已被清
36、楚界定 (參見附錄第 C.1 節 )，因此須應被優先採用作為陽性對照組。若有適當理由，亦可採用其它對照組。 定期之陽性對照試驗，可以被採用作為基準參考點。皮膚之刺激反應並非絕對之現象，所有物質均可能造成皮膚之刺激，其反應取決於劑量、物質特性及曝露程度等。因此人體皮膚刺激試驗幾乎全為相對性地，故而須與已知刺激性之化合物作比較。 5.4.5 數據與報告 5.4.5.1 數據 每位測試者之試驗結果，包括陽性及陰性對照組在內，均須以表格形式，整理出貼片移除後 24 h、 48 h、及 72 h 之刺激反應評等，並記錄所有其他觀察到之效應。 5.4.5.2 數據之評估與詮釋 本試驗之目的在測試一個物質在
37、急性曝露情況下，是否具體有造成顯著皮膚刺激之可能危害性。因此若測試材料造成皮膚刺激反應之頻率與陽性對照組相近、甚至更大時，則被認定為顯著之皮膚刺激物質。反之，若測試材料造成皮膚刺激反應之頻率顯著小於陽性對照組時，則不可被認定為顯著之皮膚刺激物。注意不可將照顧自願測試者過程之暫時性數據，與正式實驗終點之數據測試者呈現刺激反應之比率混淆。亦不可將個別測試者對皮膚刺激之感受性的差異，與測試材料造成一般皮膚刺激之可能性相混淆。 5.4.5.3 測試報告 測試報告須包括下列資訊： (a) 倫理方面之考量及自願測試者參與實驗同意書之確認。 (b) 測試材料： 物理特性，及相關之物理化學性質； 鑑定之數據；
38、 (c) 溶媒： 選用該溶媒作為固態測試材料潤溼之適當理由及其鑑定。 (d) 自願測試者： 進行測試材料試驗之自願測試者人數； 自願測試者之年齡及性別分佈； (e) 結果： 在 0、 1 h 至 2 h、 24 h、 48 h 及 72 h，及任何其它進行評分之時間點，出現反應之比率； 將每位測試者在每個觀察時間點之刺激反應數 據整理成表格形式。 (表格中應包括在貼片移除後 24 h、 48 h 及 72 h，出現刺激反應之頻率 )； 13 CNS 14393-10, T 5013-10 描述所有觀察到的刺激反應； 描述觀察到之刺激反應外之其它效應； 結果以統計分析處理 (與陽性對照組相較，例
39、如：使用 Fishers exact test)； 描述在進行自願測試者人體試 驗前進行之體外或體內之動物試驗 (若有的話 )，須包括詳細之試 驗流程、試驗結果、及對照物質； (f) 結果討論。 6. 延遲型過敏性試驗 6.1 試驗方法之選擇 最常被採用的兩種延遲型過敏性試驗方法為：天竺鼠最大化試驗 (the guinea pig maximization test, GPMT) 及密閉式貼片試驗 (Buehler test)。 最大化試驗為最靈敏之方法，較適於單一化學物質之測試。亦有報告指出其適用於萃取物之評估。然而，本方法仍以應用於單一化學物質之測試，最被完整記載。 最近，鼠科動物之局部淋
40、巴結分析 (the Murine Local Lymph Node Assay, LLNA)在國際間亦被接受作為測試單一化學物質之天竺鼠試驗之獨立替代方法 83. 備考：附錄 C 列出其它替代方法及原理。 6.2 試樣濃度之選擇 6.2.1 通則 本標準用於測試單一化學物質 之潛在過敏性，建議試驗以單一濃度進行。然而由於試驗結果與劑量大小 密切相關，因此若進行萃取物之評估試驗，建議應對萃取物進行定性及定量分析。 6.2.2 誘發 過敏率與誘發劑量大小密切相 關，因此須採中度刺激。若未達產生刺激反應之啟動閥值，則採用最大可能之濃度，唯此濃度不可危害到動物之健康。誘發濃度由各試驗方法所描述 之先期
41、性試驗決定。含一般溶劑之未經稀釋萃取物，以非口服方式投予者，不須經先導性試驗。 6.2.3 考驗 考驗濃度亦根據對未曝露於測 試材料之動物，進行先導性試驗決定。濃度應低於產生刺激反應之閥值。 建議採用一種以上之濃度進行考驗試驗，以利於結果之評估。（參見第 C.2 節） 6.3 其他影響試驗結果之重要因素 試樣之生化及物理特性，可能會影響到試驗方法的選擇。最大化試驗法必須進行皮內注射，因此若試樣無法行皮內注射，則須採用其它替代方法。 測試材料之生體可用率受到所選用溶媒之影響。沒有任何一種溶媒適用於所有材料。 溶媒之選擇須考量其溶解及滲透力以達到最佳之曝露。測試材料之濃度須為最 14 CNS 14
42、393-10, T 5013-10 高而不影響對結果之詮釋。多數研究人員偏好溶液形式之試樣，因為懸浮液傾向形成沈澱物，此將導致難以準確定量。皮內注射用之溶媒有諸如：生理食鹽水、丙二醇及植物油等。 不同實驗室試驗結果之差異，源自許多原因。下列為試驗步驟中之重要因素：試驗之室內條件、動物之測試部位、去毛之方法 (剃 /刮 )或以化學藥劑脫毛、設計之貼片型式、測試材料之量、阻隔之品質、曝露時間及動物之評估。動物之反應亦受其遺傳因子及管理而改變。 為判定一陽性之測試結果，將考驗階段呈陽性反應之動物數目，與適當之對照組測試之動物數相比較是必要的，唯反 應之嚴重程度可用以輔助詮釋測試結果。考驗階段介於邊緣
43、反應之最佳確認方式，為進行再次考驗。組織病理學無助於測試結果之評估。 為確保試驗步驟之再現性與靈敏度，須定期以已確知之接觸性過敏原，諸如：mecaptobenzothiazole 、己基肉桂醛 (hexyl cinnamic aldehyde) 及苯生卡因(bezocaine)等進行測試。 6.4 延遲型過敏性之最大化試驗 6.4.1 原理 沿用單一化合物在天竺鼠之最 大化試驗，用以評估測試材料在天竺鼠造成皮膚過敏反應之可能性。 6.4.2 試樣之製備 若測試材料為固狀或液狀，其試樣須依附錄 A 方式製備。試樣須在不影響其結果對過敏性之詮釋下，以可能之最高濃度進行測試。 (參見第 6.4.4.
44、2 節 ) 6.4.3 動物及管理 使用年輕、健康、單一遠系交配品系之成年白化雄或雌天竺鼠。試驗初始之體重應介於 300 g 至 500 g 之間。若使用雌鼠，必須是未懷孕且未經生產者。 這些實驗動物應依據 CNS 14393-2 加以照顧，使之適應。應以一組動物進行先期試驗，以決定試驗時之最佳測試濃度 (參見第 6.4.4.2 節 )。 對於粉末或液體測試材料，至 少須使用十隻動物進行試驗，同時至少以五隻動物作為對照組。若需進行先期試驗，須以額外之動物進行。 對於萃取物之測試，每個萃取 物至少須使用十隻動物進行試驗，同時至少以五隻動物作為溶劑對照組。若需進行先期試驗，須以額外之動物進行。 若
45、在十隻試驗組及五隻對照組動物之試驗結果均為陰性反應，則以另外之十隻試驗組及五隻對照組動物測試，呈現陽性結果之可能性不大。然而若出現模稜兩可之反應，則須進行再考驗 (參見第 6.4.6 節 )。若仍出現模稜兩可之反應，則須採用至少二十隻試驗組及十隻對照組動物，進行一新的測試。 6.4.4 試驗步驟 6.4.4.1 準備 在進行所有測試步驟之前，將所有測試部位之毛剃除。 對於皮內注射，每個注射點注射 0.1 mL。 15 CNS 14393-10, T 5013-10 對於局部用藥，將適當大小之濾紙或紗布吸收貼片 (4 至 8 cm2)以測試材料飽和浸潤後，貼於剃毛之皮膚表面，再以密閉式之繃帶纏繞
46、於動物之軀幹。 6.4.4.2 先期試驗 先期試驗之目的在決定第 6.4.4.3 節中之主測試採用之試樣濃度。 以常用溶劑萃取之未稀釋液 ,不需進行先期試驗。 應斟酌考慮將所有動物以注射弗氏完全佐劑 (Freunds Complete Adjuvant,FCA)進行前處理，俾便評估在主測試過程中，皮膚之受刺激狀態及因此干擾判讀之可能性。將稀釋成數種濃度之試樣，局部施加於至少三隻動物之脇腹處。 經 24 h 後，移除繃帶及貼片，利用表 4 之 Magnusson 及 Kligman 評等標準，評估施加部位之紅斑及水腫程度。 選擇僅會造成皮膚輕微紅斑，但對動物無其他副作用之最高濃度，作為主測試中局
47、部誘發階段之用。 選擇不會造成紅斑之最高濃度，作為主測試中考驗階段之用。 表 4 Magnusson 及 Kligman 評等標準 貼片試驗反應 評分數值 無可見之變化 分散或片狀之紅斑 中度且連成一片之紅斑 嚴重紅斑及水腫 0 1 2 3 6.4.4.3 主測試 6.4.4.3.1 皮內誘發階段 將下列各項物質，成對以 0.1 ml 皮內注射於每隻動物。注射部位如圖 2 之 A,B 及 C 所示。 部位 A：弗氏完全佐劑與選用溶劑以 50： 50(體積比 )混合之穩定乳液。 對於水溶性物質，以水或生理食鹽水 (BP、 USP、或等效物質 )為溶劑。 部位 B：試樣 (未稀釋之萃取物 )；對對
48、照組之動物僅注射溶劑。 部位 C： 濃度與注射於部位 B 相同之試樣，乳化分散於體積比 50： 50 之弗氏完全佐劑與溶劑之穩定乳液中。對對照組動物注射佐劑與溶劑混合之乳液。 16 CNS 14393-10, T 5013-10 圖 2 皮內注射點位置圖 1 3 說明： 1. 頭端 2. 0.1 毫升皮內注射 (參見第 6.4.4.3.1 節 ) 3 剃毛之內肩胛部位 (參見第 6.4.4.3.1 節 ) 4 尾端 6.4.4.3.2 局部誘發階段 在完成皮內誘發階段 7 天 (1 天 )後，以局部施加方式，將試樣施加於每隻動物之內肩胛部位。使用面積約 8cm2之濾紙或吸收紗布，以便覆蓋住皮內
49、注射點。採用經由第 6.4.4.3.1 節決定之濃度於部位 B。若第 6.4.4.3.1 節中可達到之最高濃度，不會造成任何刺激，則在施加局部誘發貼片 242 h 前，先將該區域以含 10% 十二烷基磺酸鈉 (sodium lauryl sulfate)之凡士林按摩進入皮膚。將貼片以一密閉性的敷料固定。 482 h 後，將貼片及敷料移除。 最好採用新鮮製備之萃取液。若萃取液貯存超過 24 h，則在貯存條件下，萃取液之安定性須加以確認。 將對照組之動物，使用空白液，進行相似之處置。 6.4.4.3.3 考驗階段 在完成局部誘發階段至少之動物，以試樣進行考驗。將試樣及對照用之溶媒以局部方式，施加於每隻動物在誘導階段未經處置之部位，例如上脅腹部位。使用適當之貼片吸入濃度由第於部位 C。亦可將此濃度稀釋，再施加於其他未經將貼片以密閉性的敷料固定。6.4.5 動物觀察 在移除敷料後 24 及 48 h，觀察實驗及對照組動物在皮膚受考驗部位之外A B C A B C 2 2 3 4 14 天 (1 天 )後，將所有測試及對照組6.4.4.3.1 節選定之試樣施加處置之部位。242 h 後，將貼
