1、 1 印行年月 94 年 10 月 本標準非經本局同意不得翻印 中華民國國家標準 CNS 總號 類號 ICS 67.100.1 N6336-214460-2經濟部標準檢驗局印行 公布日期 修訂公布日期 92 年 11 月 18 日 年月日 (共 4 頁 )食品中動物用藥殘留量檢驗方法 氯黴素之檢驗( ) Method of test for veterinary drug residues in food Test of Chloramphenicol（） 1. 適用範圍：本標準規定禽畜水產品中氯黴素（ Chloramphenicol）之檢驗。 2. 檢驗方法：氣相層析串聯質譜法 （ Gas
2、chromatography tandem mass spectrometry, GC/ MS/MS） 2.1 裝置 2.1.1 氣相層析串聯質譜儀 2.1.1.1 偵檢器：離子阱串聯質譜儀 (Ion trap tandem mass spectrometry) 2.1.1.2 層析管柱： WCOT fused silica 內徑 0.25mm30m,CP-SIL 8 CB low bleed/ MS DF=0.25（相當於 DB-5 Column 或同級品） 2.1.2 攪拌均質器（ Blender） 2.1.3 震盪器（ Vortex mixer） 2.1.4 減壓濃縮裝置（ Rotary
3、 evaporator） 2.1.5 離心機（ Centrifuge） 2.1.6 氮氣蒸發濃縮裝置（ Nitrogen evaporator）：乾式，可自動控溫。 2.1.7 真空固相萃取裝置（ Solid phase extraction vacuum manifold） 2.1.8 回旋式振盪器（ Orbital shaker）：溫度可達 80 2.2 試藥：乙酸乙酯、正己烷、甲醇採用殘量級，氯化鈉為試藥特級，氯黴素對照用標準品（ USP 級），衍生化試劑 MSTFA N-methyl-N-（ trimethyl- sily）trifluoroacetamide 2.3 器具及材料 2.
4、3.1 塑膠離心瓶： 50 mL。 2.3.2 濃縮瓶： 250 mL。 2.3.3 固相萃取層析匣： C18, 500 mg。 2.3.4 矽化處理之玻璃微量反應瓶（ Micro reaction vessels）：附鋁蓋， 1.5 mL 2.3.5 微量吸管（ Micro pipette）： 100 L 。 2.3.6 玻璃試管： 15 mL。 2.3.7 拋棄式玻璃滴管 2.4 標準溶液和衍生化標準溶液之製備 2.4.1 標準溶液之製備：精確稱取氯黴素對照用標準品約 25 mg，精確稱定，以甲醇溶解並定容至 25 mL 作為標準原液。臨用時，以甲醇稀釋成 0.01 0.5 2 CNS 1
5、4460-2, N 6336-2 2.4.2 衍生化標準溶液之製備：分別吸取標準溶液 100 L 置入微量反應瓶中，置於 50氮氣蒸發濃縮裝置，以氮氣濃縮至乾，加入 MSTFA 100 L ，於 80作用 30 分鐘，即為 10 500 ppb 衍生化標準溶液。 2.5 檢液之調製 2.5.1 萃取：檢體細切、均質後，取試樣約 5 g，精確稱定，置於 50 mL 離心瓶中，加入乙酸乙酯 30 mL，震盪 1 分鐘，再以 3500 rpm 離心 5 分鐘，將上層液倒入 250 mL 濃縮瓶，殘渣以乙酸乙酯每次 30 mL，重複萃取兩次，合併上層液，加入 4 %（ w/v）氯化鈉水溶液 4 mL，
6、經減壓濃縮去除乙酸乙酯，將剩餘氯化鈉水溶液移入 50 mL 離心瓶中，另再以 4 %（ w/v）氯化鈉水溶液2 mL 清洗濃縮瓶兩次並併入氯化鈉水溶液，再分別以正己烷 10 mL 洗濃縮瓶兩次並併入氯化鈉水溶液，震盪 30 秒，以 2000 rpm 離心 3 分鐘，靜置取下層液供第 2.5.2 節淨化用。 2.5.2 淨化：取第 2.5.1 節氯化鈉水溶液，注入 C18層析匣 (先以甲醇 3 mL 再以去離子水 3 mL 潤洗 )，調整真空固相萃取裝置流速至每秒一滴（每滴體積約0.04 mL），棄流出液。以 60 %（ v/v）甲醇水溶液 5 mL 沖提，將沖提液置於 50氮氣蒸發濃縮裝置，以
7、氮氣濃縮至約 2 mL。 2.5.3 二次萃取：取第 2.5.2 節製備之檢液，加入預先以水飽和過之乙酸乙酯 3 mL震盪 2 分鐘，以拋棄式玻璃滴管吸取上層液至玻璃試管中。重複此步驟，合併上層液於 50氮氣蒸發濃縮裝置，以氮氣濃縮至約 1 mL，再以拋棄式玻璃滴管吸取至微量反應瓶內，置於 50氮氣蒸發濃縮裝置，以氮氣濃縮至乾。 2.5.4 衍生化反應：將 MSTFA 100 L 加入第 2.5.3 節製備之樣品， 以鋁蓋密封，於 80C 震盪 150 rpm加熱 30 分鐘進行衍生化反應。反應完後，冷卻至室溫，供氣相層析質譜儀分析使用。 2.6 氣相層析串聯質譜儀偵測參考條件 2.6.1 氣
8、相層析儀條件 2.6.1.1 層析管柱溫度：起始溫度 50，恆溫 1 分鐘，以每分鐘 20升溫至240，恆溫 1 分鐘，再以每分鐘 5升溫至 280，恆溫 20 分鐘。 2.6.1.2 注入器溫度： 250。 2.6.1.3 移動相氣體：超高純度氦氣（ 99.9995 %）。 2.6.1.4 氦氣流速： 1 mL/min。 2.6.1.5 非分流注射 (splitless injection)。 2.6.1.6 注入量： 1 L ， 2.6.2 離子阱串聯質譜分析參考條件 2.6.2.1 離子阱溫度： 200。 2.6.2.2 游離電壓： 70 eV。 2.6.2.3 離子阱外室（ Manif
9、old）溫度： 50。 2.6.2.4 氣相層析儀質譜儀介面（ Transfer line）溫度： 280。 3 CNS 14460-2, N 6336-2 2.6.3 二級質譜 MS/MS 條件 Segment Description Start （ min） End （ min） Low Mass（ m/z） High Mass（ m/z） Ionization Mode Ion PreparationFIL/MUUL DELAY 0.00 12.0 40 650 None none 氯黴素 (CAP) 12 15 160 240 EI Auto MS/MS Parent Ion 母離子
10、(m/z) Excitation （ v） 斷裂電壓 Excitation Storage Level (m/z) 氯黴素 (CAP) 225 0.37 99 2.7 鑑別試驗與氯黴素含量測定：精確量取檢液或衍生化標準溶液各 1 L ，分別注入氣相層析串聯質譜儀中，參照第 2.6 節條件進行氣相層析質譜分析，就檢液與衍生化標準溶液所得波峰之相對滯留時 間與質譜圖比較鑑別之（定量離子208m/z），並依另取之衍生化標準溶液按上述方法做出標準曲線，計算檢體中氯黴素之含量 (ng/g )： 檢體中氯黴素含量 (ng/g)= MVCC：由標準曲線或分析物波峰高度檢液中求得氯黴素之濃度（ ng/mL)
11、V：衍生化試劑之體積（ 0.1 mL） M：取樣分析檢體之重量（ g） 備考 1. 本檢驗方法之檢出限量為 0.3 ng/g 2. 氯黴素 MSTFA 衍生化一級質譜為 225、 208、 361、 451 m/z，以選擇離子方式（ SIM： Selected Ions Mode）定量離子為 225、 208 m/z。 4 CNS 14460-2, N 6336-2 參考標準： 1. Pfenning, A. P., Madson, M. R., Roybal, J. E., Turnipseed, S. B., Gonzales, S. B., Gonzales, S. A., Hurlbu
12、t, J. A. and Salmon, G. D. 1998. Simultaneous Determination of Chloramphenicol, Florfenicol,and Thiamphenicol Residues in Milk by Gas Chromatography with Electron Capture Detection. J. AOAC Int. 81(4)： 714 720. 2. Kijak, P. J. 1994. Confirmation of Chloramphenicol Residues in Bovine Milk by Gas Chro
13、matography /Mass Spectrometry. J. AOAC Int. 77(1)： 34 40. 3. Nagata,T,OKA, H. 1996.Detection of Residual Chloramphenicol , Florfenicol, and Thiamphenicol in Yellowtail Fish Muscles by Capillary Gas Chromatography- Mass Spectrometry. J. Agric. Food Chem. 44(5)：1280 1284. 4. Heitzman , R.J. 1994. Veterinary Drug Residues ： Residues in Food-Producing Animals and Their Products- Reference Materials and Methods .cy3.6 Blackwell Scientific Publications, Oxford , UK.
