1、1 食品中動物用藥殘留量檢驗方法 賀爾蒙多重分析法 印月 94 10 月 本標準非經本局同意得翻印 中華民國國家標準 CNS 總號 號 ICS 65.020.30 14683 N6367 經濟部標準檢驗局印 公布日期 修訂公布日期 91 9 月 23 日 月日(共 6 頁) Method of test for veterinary drug residues in food Hormone multi-residue analysis 1. 適用範圍：本標準規定禽畜肉及其內臟中多種賀爾蒙動物用藥之殘檢驗方法，包含己雌酚 ,己烯雌酚 ,二烯水合物 ,男性烯二酮 ,雌二醇 ,2.4-二羥基 -6
2、-6 -10-二羥十二烷基苯酸丙酯 ,甲地孕酮乙酸酯 , 左旋原睪甾酮 ,-苯酸內酯， -苯酸內酯 , 17 -羥基孕固酮 ,氫基可體松等十二種。 2. 檢驗方法：氣相層析質譜法（ gas chromatography tandem mass spectrometry）。 2.1裝置 2.1.1 氣相層析質譜儀 2.1.1.1 偵檢器：子阱質譜儀 ( Ion trap tandem mass spectrometry )。 2.1.1.2 層析管柱： DB-5 (5%-diphenyl-95%-dimethylpolysiloxane copolymer)，內膜厚 0.25 m，內徑 0.25
3、mm30m 或同級品。 2.1.2 均質攪拌器 ( Homogenizer )：適用於有機溶劑者。 2.1.3 超音波振盪器 ( Sonicator ) 2.1.4 減壓濃縮裝置 ( Rotary evaporator ) 2.1.5 氮氣吹乾裝置 2.1.6 乾式加熱器 ( Dry bath incubator ) 2.1.7 心機 2.1.8 固相真空萃取裝置 （ solid phase extraction vacuum manifold） 2.2 試藥：甲醇、乙 、醋酸及正己烷皆採用液相層析級；無水酸鈉與正丙醇採用化學試藥特級；二氘雌二醇 (2d-Estradiol),碘三甲矽甲烷 (
4、trimethyl-iodosilane, TMIS), N-甲基 -N- 三甲基矽基三氟乙醯胺 (N-methyl-N-trimethyl-silytrifluoroacetamide, MSTFA), 二醣醇 (dithiothreitol, DTE) ；己雌酚 (Hexestrol), 己烯雌酚(Diethylstilbestrol,DES),二烯水合物 (Dienestrol),男性烯二酮 (Androsterone), 雌二醇 (Estradiol),2.4-二羥基 -6-6 -10-二羥十二烷基苯酸丙酯 (Zeranol),甲地孕酮乙酸酯 (Megestrol acetate),左
5、旋原睪甾酮 (Norgestrel),-苯酸內酯 (-Zearalenol),-苯酸內酯 (-Zearalenol),17 - 羥基孕固酮 (17 -Hydroxyprogesterone), 氫基可體松(Hydrocortisone)等為對照用標準品。 2.3 衍生劑混合溶液配製：取 DTE 0.1 g， MSTFA 2 mL 和 TMIS 0. 1 mL 混勻作為衍生劑混合液。此試劑應儲存於冰箱藏，儲存期約為一個月。 2.4 器具及材 2.4.1 分液斗： 125 mL。 2 CNS 14683 , N 6367 2.4.2 濃縮瓶： 150 mL。 2.4.3 離心管： 25 mL。 2
6、.4.4 定容瓶： 5 mL 2.4.5 離心管： 50 mL，內徑 3cm， polypropolyene 材質。 2.4.6 褐色反應瓶 : 1 mL、 0.1 mL。 2.4.7 固相萃取層析匣： C18， 500 mg， 10 mL。 2.4.8 濾膜： 0.45m， Teflon 材質， 13mm， 2.5 標準溶液和衍生化標準溶液之配製：取賀爾蒙對照用標準品和內標準品（ 2d- Estradiol）各約 1mg，精確稱定，以甲醇溶解並定容至 5mL，作為標準原液，使用時再以甲醇稀釋至適當濃度（ 1.0 g/mL），供作標準溶液，避光儲存於冰箱中。將 3、 5、 10、 50、 10
7、0L 之 1g/mL 標準溶液分別置入 0.1mL 反應瓶中；於 55水浴中以氮氣濃縮至將乾，加入衍生劑混合液 0.1mL (如 2.3 節描述 )，以 60衍生 30 分鐘，即為 0.03、 0.05、 0.1、 0.5、 1g/mL 之為衍生化標準溶液。 2.6 檢液之調製：取均質後之檢體約 5g，精確稱定，置入離心管，加入乙25mL及無水硫酸鈉 5g，均質 3 分鐘，以 3400rpm，在 15下離心 10 分鐘。取乙層置入分液漏斗中，而沉澱物則再加入乙12.5mL，以超音波振盪機振盪 5 分鐘後以 3400rpm，在 15下離心 10 分鐘，將兩乙 層合併置入分液漏斗中。加入經乙 飽和
8、之正己烷25mL，搖動 5 分鐘，靜置分層。取出乙 層，置入濃縮瓶中，再加入正丙醇 10mL，於 50水浴減壓濃縮至乾，以甲醇：去離子水 (6:4, v/v)溶液 3mL 清洗濃縮瓶，將洗液 3mL 經濾膜過濾，將濾液置入 C18管柱 (依序以甲醇 10mL，醋 酸 -去離子水 （ 0.1 , v/v） 溶液 5mL 和去離子水 5mL 活化 ) 以進行固相萃取。萃取後以 5mL 去離子水清洗固相萃取匣，再以乙20mL 進行沖提，以離心管收集乙 沖提液。於55水浴中以氮氣將收集之乙 沖提液濃縮至乾，加入甲醇 1mL 再溶解，將此溶液置入 1mL 棕色反應瓶中，於 55水浴中以氮氣濃縮至微乾，再
9、加入甲醇 0.1mL 再溶解，再將此溶液置入 0.1mL 褐色反應瓶中，於 55水浴中以氮氣濃縮至微乾，加入衍生劑混合液 0.1mL，以60衍生反應 30 分鐘。 2.7 鑑別試驗與含量測定：精確量取適量之檢液或衍生化標準溶液，分別注入氣相層析串聯質譜儀中，參照下列條件進行氣相層析質譜分析，就檢液與衍生化標準溶液所得波峰之相對滯留時間與質譜圖比較鑑別之，並依另取之衍生化標準溶液按上述方法做出標準曲線，計算檢體中賀爾蒙之含量 (g /g)： 檢體中賀爾蒙含量 (g /g) = MVCC：由標準曲線和分析物波峰高度求得檢液中賀爾蒙之濃度 (g/mL) V：衍生劑之體積 (0.1 mL) M：取樣分
10、析檢體之重量（ g） 氣相層析測定參考條件 層析管柱溫度：起始溫度 180，恆溫 1 分鐘，以每分鐘 6升溫至 240，恆溫 2 分鐘，再以每分鐘 6升至 290，恆溫 10 分鐘。 注入器溫度： 260 移動相氣體：氦氣 3 CNS 14683 , N 6367 氦氣流速： 1 mL/min 非分流注射 (split-less injection) 離子阱串聯質譜分析參考條件 離子源溫度： 200 離子阱溫度： 200 游離電壓： 70 電子伏特 離子阱外室（ Manifold）溫度： 90 氣相層析儀質譜儀介面（ Transfer line）溫度： 280 表二：質譜檢測設定 Segmen
11、t start min. Segment End min. low massm/z high massm/z 二次質譜離子準備模式 ion preparation二次質譜電壓 Excitation Amplitude volt channel10.0 14.0 40 500 MRM 0.38 1 MRM 0.66 2 MRM 0.60 3 14.0 16.5 40 500 MS/MS 0.47 16.5 18.5 40 500 MRM 0.87 1 MRM 0.54 2 18.5 21.0 40 600 MRM 0.61 1 MRM 0.67 2 MRM 0.67 3 MRM 0.54 5 M
12、RM 0.60 6 21.0 23.0 40 650 MS/MS 0.90 23.0 26.5 40 650 MS 1.0 註 (1)：衍生後之樣品應避免陽光照射並於六小時內完成 GC-MS/MS 檢測，避免化合物分解，影響檢測結果。 註 (2)：賀爾蒙之滯留時間、二次質譜定量特徵離子質量 賀爾蒙種類 滯留時間 (分 ) 二次質譜定量特徵離子質量二氘雌二醇 (2d-Estradiol) 17.57 287 己雌酚 (Hexestrol) 12.30 179 己烯雌酚 (Diethylstilbestrol, DES) 12.48 383 二烯水合物 (Dienestrol) 12.49 395
13、 男性烯二酮 (Androsterone) 15.35 329 雌二醇 (Estradiol) 17.58 285 2.4-二羥基 -6-6 -10-二羥十二烷基苯酸丙酯 (Zeranol) 19.42 389 甲地孕酮乙酸酯 (Megestrol acetate) 19.53 453 左旋原睪甾酮 (Norgestrel) 19.80 316 4 CNS 14683 , N 6367 -苯酸內酯 ( -Zearalenol) 20.17 324 -苯酸內酯 ( -Zearalenol) 20.39 333 17 -羥基孕固酮 (17 -Hydroxyprogesterone)21.70 44
14、1 氫基可體松 (Hydrocortisone) 25.74 632 註 (3)：賀爾蒙之最低檢出量 單位： g/kg 賀爾蒙種類 最低檢出量 己雌酚 (Hexestrol) 0.03 己烯雌酚 (Diethylstilbestrol, DES) 0.15 二烯水合物 (Dienestrol) 0.25 男性烯二酮 (Androsterone) 0.10 雌二醇 (Estradiol) 0.15 2.4-二羥基 -6-6 -10-二羥十二烷基苯酸丙酯 (Zeranol) 0.10 甲地孕酮乙酸酯 (Megestrol acetate) 0.25 左旋原睪甾酮 (Norgestrel) 0.20
15、 -苯酸內酯 ( -Zearalenol) 0.20 -苯酸內酯 ( -Zearalenol) 0.20 17 -羥基孕固酮 (17 -Hydroxyprogesterone) 0.15 氫基可體松 (Hydrocortisone) 0.05 5 CNS 14683 , N 6367 圖一：樣品前處理流程 取檢體 5 g 置入離心管 加乙25 mL 及硫酸鈉 (無水 ) 5 g，均質 3 分鐘離心 (3400 rpm， 10 分鐘， 15 ) 沉澱物 加入乙12.5 mL，振盪 5 分鐘離心 (3400 rpm， 10 分鐘， 15 ) 取乙 層 置入分液漏斗中 加正己烷 (經乙 飽和) 25
16、 mL，搖動 5 分鐘 取乙 層，置入減壓濃縮瓶中加正丙烷10mL 50減壓濃縮至乾 以甲醇與去離子水 (6:4)溶液 3mL 溶解，經濾膜過濾 將濾液置入 C18管柱 (依序經過甲醇 10mL，醋酸 -去離子水 (0.1%,v/v)溶液 5mL和去離子水 5mL 活化 )以進行固相萃取 以去離子水 5mL 進行清洗，再以乙20mL 沖提 以離心管收集沖提液 於 55水浴中以氮氣吹乾，以甲醇 1mL 再溶解 將甲醇溶液 1mL 置入褐色反應瓶（ 1mL）中 於 55水浴中以氮氣吹乾，加入甲醇 0.1mL 再溶解 取甲醇溶液 0.1mL 置入褐色反應瓶（ 0.1mL）中 於 55水浴中以氮氣吹乾
17、 在褐色反應瓶中加入 0.1mL 衍生劑混合液 以 60，衍生 30 分鐘 GC-MS 6 CNS 14683 , N 6367 參考標準 1. “Residues in food producing animals and their products: Reference Materials and Methods” Edited by R.J. Heitzman by Office for Official Publications of the Euro-pean Communities, 1992. 2. 中國國家標準 CNS 14462-N6338 “食品中動物用藥殘留量檢驗方法 -Zeranol、 17 -雌素二醇及 17 -雌素二醇之檢驗 ” 89 年 7 月 29 日公布。 3. 中國國家標準 CNS 14461-N6337 “食品中動物用藥殘留量檢驗方法 -黃體固酮、 17 -羥基助孕酮、 4-雄烯 -3， 17-二酮及睪固酮之檢驗 ” 89 年 7 月 29 日公布。
