1、 1 印行年月 94 年 10 月 本標準非經本局同意不得翻印 中華民國國家標準 CNS 總號 類號 ICS 65.120 N419414869經濟部標準檢驗局印行 公布日期 修訂公布日期 93 年 10 月 20 日 年月日 (共 3 頁 )飼料中四環素類之微生物篩檢方法 Microbiological method of screening test for Tetracyclines in feeds 1. 適用範圍：本標準規定飼料中四環素類（ Tetracyclines）之篩檢。 2. 原理：飼料中四環素類，以檸檬酸丙酮緩衝溶液萃取後，使用生物分析法測定。 3. 檢驗方法 3.1 工作
2、環境：工作平檯須寬敞、潔淨，光線良好 (操作平檯光度為 100 呎燭光（ cd； candela)，密閉室內換 氣良好，儘可能沒有灰塵及流動空氣。微生物密度之要求為每 15 分鐘落菌數不得超過 15 CFU /培養皿。 3.2 器具及材料 3.2.1 離心機（ Centrifuge）：轉速可至 4,000 rpm 者。 3.2.2 離心管（ Centrifuge tube）：玻璃或塑膠製品，容量為 50 mL。 3.2.3 酸鹼值測定儀（ pH meter） 3.2.4 離心管振盪器（ Shaker） 3.2.5 冰箱：能維持 41者。 3.2.6 培養箱：能維持內部溫差在 1以內者。 3.2
3、.7 481恆溫水槽。 3.2.8 減壓濃縮機 3.2.9 微量吸管（ Micropipette）： 20 L、 100 L、 200 L 及 1000 L。 3.2.10 吸管：已滅菌， 1 mL 者應有 0.01 mL 之刻度； 5 及 10 mL 者應有 0.1 mL之刻度。 3.2.11 培養皿：已滅菌，內徑約 9cm，高約 20cm，底皿內外平坦、無氣泡、刮傷或其他缺點者。 3.2.12 乾熱滅菌器（ Oven）：內部中心溫度能達 170以上者。 3.2.13 高壓滅菌釜（ Autoclave）：能適用 121 (約 15 lb/in2或 1 kg/cm2)滅菌 15分鐘以上者。 3
4、.2.14 不銹鋼圓筒（ Stainless cylinder）：規格外徑 80.1 mm，內徑 60.1 mm，高 100.1mm。 3.2.15 抗生素抑菌圈測讀計（ Antibiotic zone reader） ：可供量取抑菌圈之直徑者。若無本器，可使用游標尺或其他量尺。 3.2.16 試驗菌： Bacillus mycoides ATCC 11778（ CCRC 10446）。 3.2.17 試藥：鹽酸、氫氧化鉀、檸檬酸、丙酮、四環素 (Tetracycline， TC)、氯四環素 (Chlortetracycline， CTC)、羥四環素 (Oxytetracycline， OTC
5、)對照用標準品。 2 CNS 14869, N 4194 3.3 緩衝溶液之配製 3.3.1 0.2M 檸檬酸溶液：秤取檸檬酸一水合物（ C6H8O7 H2O） 42 g 以 1000 mL蒸餾水溶解定容。 3.3.2 0.5M 氫氧化鉀溶液：秤取氫氧化鉀 28 g 以 1000 mL 蒸餾水溶解定容。 3.3.3 檸檬酸丙酮緩衝溶液： 0.2M 檸檬酸溶液： 0.5M 氫氧化鉀溶液 (1： 1， v/v) ：丙酮：蒸餾水 35： 35： 30（ v/v）。 3.4 培養皿 3.4.1 抗生素培養皿 1 號（ Antibiotic Medium 1） 蛋白 (Peptone) 6.0 g 胰消
6、化酪蛋白（ Pancreatic digest of casein） 4.0 g 酵母抽出物（ Yeast extract） 3.0 g牛肉抽出物（ Beef extract） 1.5 g葡萄糖（ Dextrose） 1.0 g洋菜（ Agar） 15.0 g 蒸餾水加至 1000 mL加熱溶解，以 121滅菌 15 分鐘，作成斜面培養皿，最終 pH 值為 6.5 0.1，於滅菌後冷卻至約 48，供試驗菌繼代保存用。 3.4.2 抗生素培養皿 8 號（ Antibiotic Medium 8） 蛋白 (Peptone) 6.0 g 酵母抽出物（ Yeast extract） 3.0 g牛肉抽出
7、物（ Beef extract） 1.5 g洋菜（ Agar） 15.0 g蒸餾水加至 1000 mL 加熱溶解，以 121滅菌 15 分鐘，最終 pH 值為 8.00.1。滅菌後待冷卻至約 48，加入試驗菌液，均勻混合，培養皿每只分裝 10 mL，置於平坦檯面自然凝固備用。 3.5 試驗菌液之製備：試驗菌以抗生素培養皿 1 號於 30培養 171 小時。使用時，調其菌液濃度使添加於培養皿後，於高倍稀釋之標準溶液（ CTC 0.01 g/mL）呈現直徑約 10 mm 之抑菌圈，於低倍稀釋之標準溶液（ CTC 0.16 g/mL）呈現直徑約 1822 mm 之抑菌圈（試驗菌液於冰箱中保存不可超過
8、 2 週）。 3.6 培養皿：加適量之試驗菌液於滅菌後待冷卻至約 48之抗生素培養皿 8 號，然後取 10mL 加入培養皿中，以傾斜圓轉之動作搖動培養皿使其分布均勻，待其自然凝固。培養皿需在製備當日使用。 3.7 檢液之調製：秤取 1.0 g 適量均質飼料樣品，置入離心管內，加檸檬酸丙酮緩衝溶液 19 mL，振盪 10 分鐘，再以 3,000 rpm 離心 10 分鐘後，取上清液作為圓筒平板法之檢液。 3.8 圓筒平板法（ Cylinder plate method） 3.8.1 將經滅菌之不銹鋼圓筒投放於含試驗菌之培養皿上，按 90 度圓心角放置 4 3 CNS 14869, N 4194
9、個圓筒。 3.8.2 取上述培養皿 3 個，使用微量吸管定量吸取樣品檢液 320 L，分別注入於每個培養皿上之 4 個圓筒內。 3.8.3 於 301恆溫箱中培養 171 小時後，以抗生素抑菌圈測讀計或游標卡尺，測定樣品檢液（共 3 個值）及抗生素參比濃度（每皿 3 個值）之圓筒抑菌圈平均值，並記錄結果。 3.8.4 若檢液無明顯抑菌圈（直徑小於 12 mm）時，則表示該樣品無四環素類之殘留；有明顯抑菌圈（直徑 12 mm 以上）時，則使用 HPLC 定量。 3.9 加藥試驗：將三根試管各秤取 1 g 空白飼料，分別加入 10 g/mL 之 TC、 OTC及 CTC 各 200 L，依第 3.7 節之步驟萃取，取上清液進行圓筒平板法。 備考：本檢驗方法之最低檢出限量為 2 ppm。
