1、Mai 2016DEUTSCHE NORM Preisgruppe 8DIN Deutsches Institut fr Normung e. V. Jede Art der Vervielfltigung, auch auszugsweise, nur mit Genehmigung des DIN Deutsches Institut fr Normung e. V., Berlin, gestattet.ICS 07.100.30; 67.120.10!%Lt“2418194www.din.deDIN 10109Mikrobiologische Untersuchung von Flei
2、sch und Fleischerzeugnissen Bestimmung von aerob wachsenden Milchsurebakterien SpatelverfahrenMicrobiological analysis of meat and meat products Determination of aerobic grown latic acid bacteria Spatula methodAnalyse microbiologique de la viande et des produits base de viande Dtermination des bactr
3、ies lactiques se dveloppant en arobiose Mthode avec spatuleAlleinverkauf der Normen durch Beuth Verlag GmbH, 10772 BerlinErsatz frDIN 10109:199109www.beuth.deGesamtumfang 12 SeitenDDIN-Normenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL)DIN 10109:2016-05 2 Inhalt Seite Vorwort 3 1 Anw
4、endungsbereich . 4 2 Normative Verweisungen . 4 3 Begriffe 4 4 Kurzbeschreibung des Verfahrens 4 5 Chemikalien und Nhrboden 5 6 Gerte . 8 7 Probenahme 8 8 Durchfhrung 9 9 Auswertung 9 10 Untersuchungsbericht . 11 Literaturhinweise . 12 DIN 10109:2016-05 3 Vorwort Diese Norm wurde vom Arbeitsausschus
5、s NA 057-01-06-AA Mikrobiologie der Lebensmittelkette“ im DIN-Normenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL) erarbeitet. Es wird auf die Mglichkeit hingewiesen, dass einige Elemente dieses Dokuments Patentrechte berhren knnen. Das DIN und/oder die DKE sind nicht dafr verantwortl
6、ich, einige oder alle diesbezglichen Patentrechte zu identifizieren. nderungen Gegenber DIN 10109:1991-09 wurden folgende nderungen vorgenommen: a) Abschnitt 2 Normative Verweisungen“ aufgenommen; b) Abschnitt 5.4 Leistungsprfung zur Qualittssicherung der Nhrmedien“ aufgenommen; c) technische und re
7、daktionelle berarbeitung sowie Ergnzungen zwecks Anpassung an die derzeit gltigen Gestaltungsregeln. Frhere Ausgaben DIN 10109: 1991-09 DIN 10109:2016-05 4 1 Anwendungsbereich Diese Norm legt ein Verfahren zur Bestimmung aerob wachsender Milchsurebakterien fest. Das Verfahren ist bei Fleisch und Fle
8、ischerzeugnissen sowie Erzeugnissen mit einem Zusatz von Fleisch und Fleischerzeugnissen anwendbar. 2 Normative Verweisungen Die folgenden Dokumente, die in diesem Dokument teilweise oder als Ganzes zitiert werden, sind fr die Anwendung dieses Dokuments erforderlich. Bei datierten Verweisungen gilt
9、nur die in Bezug genommene Ausgabe. Bei undatierten Verweisungen gilt die letzte Ausgabe des in Bezug genommenen Dokuments (einschlielich aller nderungen). DIN EN ISO 6887-1, Mikrobiologie von Lebensmitteln und Futtermitteln Vorbereitung von Untersuchungsproben und Herstellung von Erstverdnnungen un
10、d von Dezimalverdnnungen fr mikrobiologische Untersuchungen Teil 1: Allgemeine Regeln fr die Herstellung von Erstverdnnungen und Dezimalverdnnungen DIN EN ISO 6887-2, Mikrobiologie von Lebensmitteln und Futtermitteln Vorbereitung von Untersuchungsproben und Herstellung von Erstverdnnungen und von De
11、zimalverdnnungen fr mikrobiologische Untersuchungen Teil 2: Spezifische Regeln fr die Vorbereitung von Fleisch und Fleischerzeugnissen DIN EN ISO 11133, Mikrobiologie von Lebensmitteln, Futtermitteln und Wasser Vorbereitung, Herstellung, Lagerung und Leistungsprfung von Nhrmedien 3 Begriffe Fr die A
12、nwendung dieses Dokuments gilt der folgende Begriff. 3.1 aerob wachsende Milchsurebakterien heterogene Gruppe grampositiver, katalasenegativer Mikroorganismen, die die Genera D-Streptokokken“, Lactobacillus, Streptococcus, Enterococcus (frher N-Streptokokken“), Pediococcus und Leuconostoc sowie atyp
13、ische Laktobazillen umfasst, welche nach dem in dieser Norm festgelegten Verfahren auf dem MRS-Nhrboden, modifiziert1), Kolonien bilden Anmerkung 1 zum Begriff: Laktobazillen sind nicht sporenbildende Stbchen. Streptokokken, Enterokokken und Laktokokken sind Diplo- oder Kettenkokken. Pediokokken sin
14、d kleine Paketkokken und Leuconostoc-Spezies kokkoide Zellen. Atypische Laktobazillen, die zu dem Genus Carnobacterium gehren, kommen nicht zur Entwicklung. Anmerkung 2 zum Begriff: Der MRS-Nhrboden, modifiziert, schliet weitgehend andere Stammformen, die nicht zu den Milchsurebakterien gehren, aus.
15、 Die Abgrenzung anderer Mikroorganismen kann durch geeignete Tests (Katalase-Test oder mikroskopisches Prparat) erfolgen. 4 Kurzbeschreibung des Verfahrens Agarplatten mit dem selektiven Nhrboden werden mit Teilmengen von jeweils 0,1 ml der unverdnnten, homogenisierten Probe oder der Erstverdnnung u
16、nd der weiteren Verdnnungen jeweils im Doppelansatz beimpft. Bei einer Temperatur von 25 C wird unter aeroben Bedingungen 3 Tage bebrtet. Aus der Koloniezahl wird die Anzahl der Milchsurebakterien je g oder ml der Probe berechnet. 1) MRS-Nhrboden, modifiziert = de: Man-Rogosa-Sharpe, pH = 5,7 (modif
17、iziert), gegebenenfalls mit 0,14 % Sorbinsure DIN 10109:2016-05 5 5 Chemikalien und Nhrboden 5.1 Allgemeines Die Nhrbodenbestandteile und Chemikalien mssen fr mikrobiologische Zwecke geeignet sein. Um vergleichbare Ergebnisse zu erhalten, sind eindeutig deklarierte Nhrbodenbestandteile und analysenr
18、eine Chemikalien oder Trockennhrbden zu verwenden. Den Anweisungen des Herstellers ist strikt zu folgen. Das verwendete Wasser muss entweder in Glasgerten destilliert oder entmineralisiert und mindestens von entsprechender Reinheit sein. Es darf keine Bestandteile enthalten, die das Wachstum von Mik
19、roorganismen beeinflussen. 5.2 Lactobacillus-Agar, nach de Man, Rogosa und Sharpe, pH-Wert 5,7 (MRS-Nhrboden, modifiziert)1)5.2.1 Grundnhrboden 5.2.1.1 Zusammensetzung Pepton aus Casein, tryptisch verdaut 10,0 g Fleischextrakt 8,0 g Hefeextrakt-Pulver 4,0 g Glucose 20,0 g Tween 802)(Polyoxyethylenso
20、rbitanmonooleat) 1,0 g di-Kaliumhydrogenphosphat, K2HPO42,0 g Magnesiumsulfat, MgSO4 7H2O (entspricht 20 ml Lsung nach 5.2.2) 0,2 g Mangansulfat, MnSO4 4H2O (entspricht 5 ml Lsung nach 5.2.3) 0,05 g di-Ammoniumhydrogencitrat, C6H14N2O72,0 g Natriumacetat, CH3COONa 5,0 g Agar, je nach Geliereigenscha
21、ften 12,0 g bis 15,0 g Wasser 1 000 ml zustzlich, falls hohe Fremdkeimgehalte, insbesondere Hefen unterdrckt werden sollen: Sorbinsure (entspricht 14 ml Lsung nach 5.2.4) 1,4 g ANMERKUNG Der Nhrboden ohne Sorbinsure ist als Trockennhrboden im Handel erhltlich. Bei Eigenherstellung werden die Lsungen
22、 erst vor der pH-Wert-Einstellung nach 5.2.5.2 zugesetzt. 1) MRS-Nhrboden, modifiziert = de: Man-Rogosa-Sharpe, pH = 5,7 (modifiziert), gegebenenfalls mit 0,14 % Sorbinsure 2) Tween ist ein Warenzeichen der ICI-America Inc. Diese Angabe dient zur Unterrichtung der Anwender dieser Norm und bedeutet k
23、eine Anerkennung des genannten Produktes durch DIN. Gleichwertige Produkte drfen verwendet werden, wenn sie nachweisbar zu den gleichen Ergebnissen fhren. DIN 10109:2016-05 6 5.2.1.2 Herstellung Die Nhrbodenbestandteile werden in Wasser suspendiert und zum vollstndigen Lsen wird kurz aufgekocht. Der
24、 Nhrboden wird 15 min bei 121 C sterilisiert. Vor dem Zusatz der Lsungen und der pH-Wert-Einstellung wird der Grundnhrboden auf 50 C im Wasserbad abgekhlt. 5.2.2 Magnesiumsulfat-Lsung 5.2.2.1 Zusammensetzung Magnesiumsulfat, MgSO4 7H2O 1,0 g Wasser 100 ml 5.2.2.2 Herstellung Das Magnesiumsulfat wird
25、 in Wasser gelst und 60 min bei 100 C sterilisiert. Die Lsung darf bei einer Temperatur zwischen 0 C und 5 C mehrere Monate aufbewahrt werden. 5.2.3 Mangansulfat-Lsung 5.2.3.1 Zusammensetzung Mangansulfat, MnSO4 H2O 1,0 g Wasser 100 ml 5.2.3.2 Herstellung Das Mangansulfat wird in Wasser gelst und 60
26、 min bei 100 C sterilisiert. Die Lsung darf bei einer Temperatur zwischen 0 C und 5 C mehrere Monate aufbewahrt werden. 5.2.4 Sorbinsure-Lsung 5.2.4.1 Zusammensetzung Sorbinsure, C6H8O210,0 g leicht alkalisches Wasser (schwach alkalisiert mit etwa 20 ml einer Natronlauge c(NaOH) = 1 mol/l) 100 ml 5.
27、2.4.2 Herstellung Die Sorbinsure wird in 70 ml sterilem Wasser angelst, kurz auf etwa 60 C erwrmt und nach Zusatz von etwa 20 ml Natronlauge c(NaOH) = 1 mol/l bis zum vollstndigen Lsen geschttelt und anschlieend auf 100 ml aufgefllt. 5.2.5 Vollstndiger Nhrboden 5.2.5.1 Zusammensetzung Grundnhrboden
28、nach 5.2.1 1 000 ml Magnesiumsulfat-Lsung nach 5.2.2 20 ml Mangansulfat-Lsung nach 5.2.3 5 ml Falls erforderlich (siehe 5.2.1.1): Sorbinsure-Lsung nach 5.2.4 14 ml DIN 10109:2016-05 7 5.2.5.2 Herstellung Dem nach 5.2.1.2 hergestellten und auf 50 C abgekhlten Grundnhrboden werden die anderen Lsungen
29、einzeln und unter stndigem Rhren zugegeben. Der pH-Wert ist bei 50 C mit 10 %iger3)HCI auf 5,8 0,1 einzustellen. Der pH-Wert der fertigen Platten betrgt dann 5,6 bis 5,9 bei etwa 25 C. Es wird empfohlen, den pH-Wert der fertigen Platten zu kontrollieren. 5.2.6 Herstellen von Agarplatten Teilmengen v
30、on etwa 15 ml des vollstndigen Nhrbodens werden in Petrischalen bergefhrt und zum Verfestigen stehen gelassen. Wenn die Agarplatten nicht unmittelbar nach der Herstellung verwendet werden, sind sie bei einer Temperatur zwischen 2 C und 8 C nicht lnger als 5 Tage bis 7 Tage aufzubewahren. Unmittelbar
31、 vor der Verwendung werden die Platten mit der Agaroberflche nach unten, schrg auf dem abgenommenen Deckel liegend, in einem Brutschrank (6.1) getrocknet, der auf eine Temperatur zwischen 25 C und 50 C eingestellt ist oder in einer Laminar-Flow-Sicherheitswerkbank so lange, bis die Wassertrpfchen vo
32、n der Oberflche des Mediums verschwunden sind. 5.3 Verdnnungslsungen Nach DIN EN ISO 6887-1 und DIN EN ISO 6887-2. 5.4 Leistungsprfung zur Qualittssicherung der Nhrmedien Zur Definition der Produktivitt und Selektivitt siehe DIN EN ISO 11133. In den Tabellen 1 und 2 sind die Leistungsprfungen fr den
33、 modifizierten MRS-Agar und die Verdnnungsflssigkeiten aufgefhrt. Tabelle 1 Leistungsprfung von MRS-Agar, modifiziert Funktion Bebrtung Kontrollstmme Referenz-Medium Prfverfahren Kriterien charakteristische Reaktionen Produktivitt (72 3) h / (30 1) C Lactobacillus sakei WDCM 00015a bereits validiert
34、e Medien-Charge von MRS-Agar Quantitativ PR 0,7 Charakteristische Kolonien je nach Spezies Pediococcus pentosaceus WDCM 00158 Lactococcus lactis WDCM 00016aSelektivitt (72 3) h / (30 1) C Escherichia coli WDCM 00012 oder WDCM 00013 Qualitativ Vollstndige Hemmung (0) Bacillus cereus WDCM 00001 aDurch
35、 das Laboratorium des Anwenders zu verwendende Stmme (als Minimum). 3) Massenanteile. DIN 10109:2016-05 8 Tabelle 2 Leistungsprfung der Verdnnungsflssigkeiten Medium Bebrtung Kontrollstmme Referenz-Medium Prfverfahren Kriterien Peptonsalz-Lsung 45 min bis 1 h / 20 C bis 25 C Escherichia coli WDCM 00
36、012 oder WDCM 00013TSAb Quantitativ 30 % Kolonien/T0 ( 30 % der Ausgangskeimzahl) Staphylococcus aureus WDCM 00034aGepuffertes Peptonwasser 45 min bis 1 h / 20 C bis 25 C Escherichia coli WDCM 00012 oder WDCM 00013 Staphylococcus aureus WDCM 00034aTSAbQualitativ 30 % Kolonien/T0 ( 30 % der Ausgangsk
37、eimzahl) aDurch das Laboratorium des Anwenders zu verwendende Stmme (als Minimum). bTrypton-Soja-Agar. 6 Gerte Alle Glasgerte mssen vor der Verwendung sorgfltig gereinigt und sterilisiert werden. Kunststoffgerte mssen steril sein. Zustzlich zu den in DIN EN ISO 6887-1 und DIN EN ISO 6887-2 aufgefhrt
38、en Gerten werden die Gerte nach 6.1 bis 6.5 bentigt. ANMERKUNG Mechanische Pipetten und andere Gerte fr die mechanisierte und automatisierte Durchfhrung der Arbeitsvorgnge knnen verwendet werden, sofern durch entsprechende Untersuchungen sichergestellt ist, dass vergleichbare Ergebnisse erzielt werd
39、en knnen. 6.1 Brutschrank, einstellbar auf 25 C bis 50 C. 6.2 Brutschrank, einstellbar auf (25 1) C, z. B. Brutschrank nach Literaturhinweis 1. 6.3 Wasserbder, zum Erhitzen und Khlen der Lsungen und des Nhrbodens auf geeignete Temperaturen. 6.4 Petrischalen, Durchmesser etwa 9 cm, z. B. Petrischalen
40、 nach Literaturhinweis 2. 6.5 Spatel, Durchmesser etwa 3,5 mm, Ausstrichbreite 30 mm. Die Schnittkanten an den Enden mssen geglttet sein. 6.6 Laminar-Flow-Sicherheitswerkbank. 7 Probenahme Nach DIN EN ISO 6887-1 und DIN EN ISO 6887-2. DIN 10109:2016-05 9 8 Durchfhrung 8.1 Allgemeines Die Zeit von Be
41、ginn der Herstellung der Erstverdnnung nach 8.4 bis zur Beimpfung des Nhrbodens nach 8.6 darf 30 min nicht berschreiten. 8.2 Vorbereitung der Verdnnungsrhrchen Nach DIN EN ISO 6887-1 und DIN EN ISO 6887-2. 8.3 Vorbereitung der Probe Nach DIN EN ISO 6887-1 und DIN EN ISO 6887-2. 8.4 Herstellung der E
42、rstverdnnung Nach DIN EN ISO 6887-1 und DIN EN ISO 6887-2. 8.5 Herstellung weiterer Dezimalverdnnungen Nach DIN EN ISO 6887-1 und DIN EN ISO 6887-2. 8.6 Beimpfung 8.6.1 Die Verdnnungsreihe wird im Doppelansatz untersucht. Mit einer sterilen Pipette werden jeweils 0,1 ml der unverdnnten homogenisiert
43、en Probe oder der Erstverdnnung und der weiteren Verdnnungen auf je 2 Agarplatten gegeben. Dabei ist mit der hchsten Verdnnung zu beginnen. Bevor die Teilmengen auf die Platten bergefhrt werden, ist die Pipette dreimal zu fllen und zu leeren. Die Teilmengen werden mit Spateln unverzglich auf der Obe
44、rflche der Agarplatten in kreisender Bewegung gleichmig verteilt. 8.6.2 Sofern geringe Anzahlen von Milchsurebakterien erfasst werden sollen, wird 1 ml einer unverdnnten homogenisierten Probe oder der Erstverdnnung auf den Oberflchen von 3 Agarplatten bis 4 Agarplatten gleichmig verteilt und mit ein
45、em Spatel ausgestrichen. Ein Doppelansatz ist erforderlich. 8.7 Bebrtung Die beimpften Platten werden mit dem Boden nach oben 3 Tage im Brutschrank nach 6.2 bei einer Temperatur von 25 C bebrtet. 9 Auswertung 9.1 Zhlen der Kolonien 9.1.1 Alle nach 8.6 beimpften und nach 8.7 bebrteten gut gewachsenen
46、 Kolonien, wei oder grau-wei, flach oder erhaben, glatt oder rauh, sind als Milchsurebakterien zu zhlen. 9.1.2 Beim Zhlen werden nur solche Platten bercksichtigt, die zwischen 1 Kolonie und 150 Kolonien enthalten. Bei gegebener Auswertbarkeit bzw. gut abgesetzten Einzelkolonien knnen auch Platten mi
47、t bis zu 300 Kolonien herangezogen werden. 9.1.3 Wenn weniger als 15 Kolonien auf den Platten mit einer unverdnnten homogenisierten Probe oder mit der niedrigsten Verdnnung (Erstverdnnung) vorhanden sind, werden diese Platten zur Schtzung der Milchsurebakterien-Anzahl herangezogen (siehe 9.3). 9.1.4
48、 Die nach 8.6.2 beimpften 3 Platten bis 4 Platten werden bei allen Auswertungsschritten und bei der Besttigung als eine Platte behandelt. DIN 10109:2016-05 10 9.2 Berechnung der Keimzahl Es werden Platten aus den Verdnnungsstufen herangezogen, auf denen 1 typische Kolonie bis 150 typische Kolonien gewachsen sind. Dabei muss aber mindestens eine Verdnnungsstufe Platten enthalten, auf denen zwischen 15 typische Kolonien und 150 typische Kolonien vorliegen. Liegen gut abgesetzte Einzelkolonien vor, knnen auch Platten mit bis zu 300 Kolonien herangezogen werden. Aus den
