1、Mai 2013DEUTSCHE NORM Normenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL) im DINPreisgruppe 13DIN Deutsches Institut fr Normung e. V. Jede Art der Vervielfltigung, auch auszugsweise, nur mit Genehmigung des DIN Deutsches Institut fr Normung e. V., Berlin, gestattet.ICS 07.100.30!$r#“
2、1957900www.din.deDDIN 10135Mikrobiologie von Lebensmitteln und Futtermitteln Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zum Nachweis von pathogenenMikroorganismen in Lebensmitteln Verfahren zum Nachweis von SalmonellenMicrobiology of food and animal feeding stuffs Polymerase chain reaction (PCR) for the detect
3、ion of food-borne pathogens Method for the detection of salmonellaMicrobiologie des aliments Raction de polymrisation en chane (PCR) pour la dtection des micro-organismespathognes dans les aliments Mthode de recherche des salmonellaAlleinverkauf der Normen durch Beuth Verlag GmbH, 10772 BerlinErsatz
4、 frDIN 10135:1999-11www.beuth.deGesamtumfang 27 SeitenDIN 10135:2013-05 2 Inhalt Seite Vorwort . 3 1 Anwendungsbereich 4 2 Normative Verweisungen . 4 3 Begriffe 5 4 Symbole und Abkrzungen . 6 5 Kurzbeschreibung 7 6 Chemikalien und Reagenzien 8 7 Gerte . 9 8 Durchfhrung 10 9 Untersuchungsbericht . 11
5、 Anhang A (informativ) Thermischer Zellaufschluss . 12 Anhang B (informativ) Amplifikationskontrollen 13 Anhang C (informativ) PCR-ELISA zum Nachweis von Salmonellen 16 Anhang D (informativ) Real-time-PCR-Assay zum Nachweis von Salmonellen 21 Anhang E (informativ) Ringversuchsergebnisse 26 Literatur
6、hinweise . 27 DIN 10135:2013-05 3 Vorwort Diese Norm wurde vom Normenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte, Arbeitskreis NA 057-01-06-01 AK Polymerase-Kettenreaktion zum Nachweis von Mikroorganismen“, erarbeitet. Es wird auf die Mglichkeit hingewiesen, dass einige Texte dieses Doku
7、ments Patentrechte berhren knnen. Das DIN ist nicht dafr verantwortlich, einige oder alle diesbezglichen Patentrechte zu identifizieren. nderungen Gegenber DIN 10135:1999-11 wurden folgende nderungen vorgenommen: a) die Norm wurde in der Struktur gendert und enthlt neu die Anhnge A bis E; b) als wei
8、teres Verfahren wurde ein Real-time-PCR-Assay zum Nachweis von Salmonellen aufgenommen. Frhere Ausgaben DIN 10135: 1999-11 DIN 10135:2013-05 4 1 Anwendungsbereich Diese Norm legt ein Verfahren zum Nachweis von Salmonellen in Lebensmitteln und Futtermitteln und aus diesen gewonnenen Isolaten mit der
9、Polymerase-Kettenreaktion einschlielich der Real-time-PCR fest. Diese Norm gilt fr Erzeugnisse, die fr den menschlichen Verzehr oder als Futtermittel bestimmt sind, und fr Umgebungsproben im Bereich der Herstellung und der Behandlung von Lebensmitteln. 2 Normative Verweisungen Die folgenden Dokument
10、e, die in diesem Dokument teilweise oder als Ganzes zitiert werden, sind fr die Anwendung dieses Dokuments erforderlich. Bei datierten Verweisungen gilt nur die in Bezug genommene Ausgabe. Bei undatierten Verweisungen gilt die letzte Ausgabe des in Bezug genommenen Dokuments (einschlielich aller nde
11、rungen). DIN EN ISO 6579, Mikrobiologie von Lebensmitteln und Futtermitteln Horizontales Verfahren zum Nachweis von Salmonella spp. DIN EN ISO 6887-1, Mikrobiologie von Lebensmitteln und Futtermitteln Vorbereitung von Untersuchungsproben und Herstellung von Erstverdnnungen und von Dezimalverdnnungen
12、 fr mikrobiologische Untersuchungen Teil 1: Allgemeine Regeln fr die Herstellung von Erstverdnnungen und Dezimalverdnnungen DIN EN ISO 6887-2, Mikrobiologie von Lebensmitteln und Futtermitteln Vorbereitung von Untersuchungsproben und Herstellung von Erstverdnnungen und von Dezimalverdnnungen fr mikr
13、obiologische Untersuchungen Teil 2: Spezifische Regeln fr die Vorbereitung von Fleisch und Fleischerzeugnissen DIN EN ISO 6887-3, Mikrobiologie von Lebensmitteln und Futtermitteln Vorbereitung von Untersuchungsproben und Herstellung von Erstverdnnungen und von Dezimalverdnnungen fr mikrobiologische
14、Untersuchungen Teil 3: Spezifische Regeln fr die Vorbereitung von Fisch und Fischerzeugnissen DIN EN ISO 6887-4, Mikrobiologie von Lebensmitteln und Futtermitteln Vorbereitung von Untersuchungsproben und Herstellung von Erstverdnnungen und von Dezimalverdnnungen fr mikrobiologische Untersuchungen Te
15、il 4: Spezifische Regeln fr die Vorbereitung von anderen Erzeugnissen als Milch und Milcherzeugnissen, Fleisch und Fleischerzeugnissen, Fisch und Fischerzeugnissen DIN EN ISO 6887-5, Mikrobiologie von Lebensmitteln und Futtermitteln Vorbereitung von Untersuchungsproben und Herstellung von Erstverdnn
16、ungen und von Dezimalverdnnungen fr mikrobiologische Untersuchungen Teil 5: Spezifische Regeln fr die Vorbereitung von Milch und Milcherzeugnissen DIN EN ISO 7218, Mikrobiologie von Lebensmitteln und Futtermitteln Allgemeine Anforderungen und Leitlinien fr mikrobiologische Untersuchungen DIN EN ISO
17、20837:2006-08, Mikrobiologie von Lebensmitteln und Futtermitteln Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zum Nachweis von pathogenen Mikroorganismen in Lebensmitteln Anforderungen an die Probenvorbereitung fr den qualitativen Nachweis (ISO 20837:2006); Deutsche Fassung EN ISO 20837:2006 DIN EN ISO 20838, Mi
18、krobiologie von Lebensmitteln und Futtermitteln Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zum Nachweis von pathogenen Mikroorganismen in Lebensmitteln Anforderungen an Amplifikation und Nachweis bei qualitativen Verfahren DIN 10135:2013-05 5 DIN EN ISO 22118, Mikrobiologie von Lebensmitteln und Futtermitteln
19、Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zum Nachweis und zur quantitativen Bestimmung von pathogenen Mikroorganismen in Lebensmitteln Leistungsmerkmale DIN EN ISO 22119, Mikrobiologie von Lebensmitteln und Futtermitteln Real-time-Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zum Nachweis von pathogenen Mikroorganismen in
20、 Lebensmitteln Allgemeine Anforderungen und Begriffe DIN EN ISO 22174, Mikrobiologie von Lebensmitteln und Futtermitteln Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zum Nachweis von pathogenen Mikroorganismen in Lebensmitteln Allgemeine Anforderungen und Begriffe 3 Begriffe Fr die Anwendung dieses Dokuments gel
21、ten die Begriffe nach DIN EN ISO 22174, DIN EN ISO 22119 und die folgenden Begriffe. 3.1 Salmonellen Gram-negative Bakterien aus der Familie der Enterobacteriaceae Anmerkung 1 zum Begriff: Die Gattung Salmonella umfasst die beiden Arten Salmonella enterica, mit sechs bekannten Unterarten, und Salmon
22、ella bongori. 3.2 Salmonellen-spezifische DNS-Sequenzen Genombereiche, die fr den spezifischen Nachweis von Salmonellen im Rahmen dieser Norm geeignet sind 3.3 PCR-ELISA PCR-Enzyme-Linked-Immuno-Sorbent-Assay Nachweisverfahren, bei dem Amplifikate an einer Festphase (z. B. in Mikrotiterplatten) durc
23、h immunochemische Detektion nachgewiesen werden 3.4 Real-time-Polymerase-Kettenreaktion Real-time-PCR enzymatisches Verfahren, bei dem die In-vitro-Amplifikation bestimmter DNS-Abschnitte durch einen Prozess der Denaturierung, Anlagerung (Annealing) spezifischer Primer und DNS-Synthese mit dem Nachw
24、eis spezifischer PCR-Produkte (Amplifikate) whrend des Amplifikationsprozesses kombiniert wird Anmerkung 1 zum Begriff: Im Allgemeinen enthlt das Reaktionsgemisch fr die Amplifikation eine oder mehrere spezifische DNS-Sonden, die mit einem oder mehreren Fluoreszenzfarbstoffen gekoppelt sind. Bei der
25、 Anwendung dieser Technik wird das Signal nach spezifischer Hybridisierung der Sonden an die Nukleinsure-Zielsequenz und Anregung mit Licht definierter Wellenlnge erzeugt. DIN 10135:2013-05 6 4 Symbole und Abkrzungen Fr die Anwendung dieses Dokuments gelten die folgenden Symbole und Abkrzungen. c St
26、offmengenkonzentration g 9,81 mnulls2w Massenanteil Massenkonzentration Volumenanteil U Einheit (en: unit) einer Enzymaktivitt, die bei einer definierten Temperatur eine vorgegebene Substratmenge je Zeiteinheit umsetzt. Sie ist hersteller- und produktspezifisch festgelegt. Anti-DIG Anti-Digoxigenin-
27、Antikrper BHQ2 N-Nitrophenylazo-dimethoxy-phenylazo-phenyl-N-dimethoxytrityloxy-ethyl-2- aminoethyl-1-oxyglycolate (Black-Hole Quencher 2) bp Basenpaare BPW Gepuffertes Peptonwasser BSA Bovines Serum Albumin DNS Desoxyribonukleinsure (en: deoxyribonucleic acid) dNTP Desoxyribonukleosid-Triphosphat d
28、ATP Desoxyadenintriphosphat dCTP Desoxycytidintriphosphat dGTP Desoxyguanosintriphosphat dTTP Desoxythymidintriphosphat dsDNS Doppelstrang-DNS Na2EDTA Dinatriumsalz der Ethylendiamintetraessigsure, C10H14N2Na2O8ELISA Enzyme-Linked-Immuno-Sorbent-Assay FAM 6-Carboxyfluorescein h Stunde HEX Hexachloro
29、-6-carboxy-fluoreszein IK- Interne Amplifikationskontroll- IK-DNS Interne Amplifikationskontroll-DNS KbE Kolonie-bildende Einheiten min Minute PBS Phosphat-gepufferte Salzlsung (en: phosphate-buffered-saline) DIN 10135:2013-05 7 PCR Polymerase-Kettenreaktion (en: polymerase chain reaction) POD Perox
30、idase ROX Carboxy-X-Rhodamin RVS-Medium Magnesiumchlorid-Malchitgrn-Medium nach Rappaport-Vassiliadis mit Soja s Sekunden SSC Standard Saline Citrat TAMRA 6-Carboxy-tetramethylrhodamin Taq Thermus aquaticus TE Tris-EDTA TexasRed Sulforhodamin-101-Sulfonylchlorid TmSchmelzpunkttemperatur TMB 3,3,5,5-
31、Tetramethylbenzidin Tris-HCl Tris(hydroxymethyl)-aminomethan-Hydrochlorid 5 Kurzbeschreibung 5.1 Allgemeines Die Untersuchung gliedert sich in vier aufeinanderfolgende Schritte: a) nichtselektive und/oder selektive Anreicherung (siehe 5.2); b) Nukleinsureextraktion (siehe 5.3); c) Amplifikation der
32、gesuchten Nukleinsuresequenz mittels spezifischer Primer in der PCR; d) Detektion mit einer Besttigungsreaktion mittels Hybridisierung oder DNS-Sequenzierung (siehe 5.4). ANMERKUNG Bei der Real-time-PCR erfolgt die spezifische Amplifikation und Detektion blicherweise fortlaufend in einem Schritt ohn
33、e das Reaktionsgef zwischen beiden Schritten ffnen zu mssen. Um eine PCR-Inhibition durch die Matrix zu erfassen, muss eine Kontroll-DNS in der gleichen Matrix amplifiziert werden, siehe Anhang B zu Amplifikationskontrollen. 5.2 Mikrobielle Anreicherung Die Proben werden in einem flssigen nichtselek
34、tiven und/oder selektiven Nhrmedium bebrtet. Dabei muss sichergestellt sein, dass mit den gewhlten Bedingungen ein PCR-Nachweis von Salmonellen gefhrt werden kann. Die Sensitivitt muss mindestens dem kulturellen Verfahren nach DIN EN ISO 6579 entsprechen. Fr die Probenvorbereitung von Lebensmitteln
35、gelten fr die jeweils spezifische Anwendung die DIN EN ISO 6887-1 bis DIN EN ISO 6887-5. 5.3 Nukleinsureextraktion Aus einer bestimmten Menge der mikrobiellen Anreicherung werden die Mikroorganismen separiert, die Zellen aufgeschlossen und anschlieend die Nukleinsure extrahiert und gegebenenfalls zu
36、r Vermeidung PCR-DIN 10135:2013-05 8 inhibitorischer Effekte gereinigt. Es gelten die in DIN EN ISO 20837 festgelegten Anforderungen an die Probenvorbereitung fr den qualitativen Nachweis. 5.4 Amplifikation mittels PCR und Detektion spezifischer Amplifikate Ein festgelegtes Volumen an extrahierter N
37、ukleinsure wird zu einem PCR-Ansatz gegeben und in einem Gert amplifiziert, welches die verschiedenen Temperatur- und Zeitzyklen, die fr die PCR notwendig sind, reproduzierbar durchfhrt. Die Temperaturdifferenz zwischen den Reaktionsanstzen in verschiedenen Reaktionsgefen darf 1 C nicht berschreiten
38、. Bei Verwendung eines Gertes ohne Deckelheizung mssen die Reaktionsanstze mit geeigneten Manahmen vor Evaporation geschtzt werden. Bei Verwendung eines Real-Time-PCR-Gertes muss die optische Detektionseinheit geeignet sein, Fluoreszenzsignale zwischen den Amplifikationszyklen zuverlssig zu detektie
39、ren. ANMERKUNG Bei der Real-time-PCR erfolgt die spezifische Amplifikation und Detektion in einem Schritt. Die Spezifitt der Amplifikate muss mittels einer Hybridisierung (z. B. Oligonukleotid-Sonde) oder DNS-Sequenzierung nachgewiesen bzw. besttigt werden. Beispiele sind informativ in Anhang C (Kol
40、orimetrischer Nachweis mittels einer Besttigungsreaktion in Mikrotiterplatten) und D.1 bis D.3 (Real-time-PCR Verfahren) genannt. Ein mikrobiologisch-kultureller Befund kann auch zur Besttigung herangezogen werden. 6 Chemikalien und Reagenzien 6.1 Allgemeines Es gelten die grundstzlichen Anforderung
41、en nach DIN EN ISO 22174. 6.2 Nhrmedien 6.2.1 Nichtselektive Nhrmedien Zur nichtselektiven mikrobiellen Anreicherung eignet sich z. B. gepuffertes Peptonwasser nach DIN EN ISO 6579. Alternativ drfen auch andere wissenschaftlich erprobte und nach einem anerkannten Protokoll validierte Anreicherungsme
42、dien wie z. B. sterile H-Milch eventuell unter Zusatz von Hemmsubstanzen verwendet werden. 6.2.2 Selektive Nhrmedien Zur selektiven mikrobiellen Anreicherung eignen sich Medien nach DIN EN ISO 6579, z. B. Rappaport-Vassiliadis-Medium mit Soja. Alternativ drfen auch andere wissenschaftlich erprobte u
43、nd nach einem anerkannten Protokoll validierte Anreicherungsverfahren verwendet werden. 6.3 Nukleinsureextraktion und -reinigung Besondere Anforderungen an die Nukleinsureextraktion und -reinigung werden in DIN EN ISO 20837 festgelegt. Anhang A legt informativ die Durchfhrung eines thermischen Zella
44、ufschlusses fest. Im Handel erhltliche Extraktions- und Purifikationssysteme drfen bei Eignung angewendet werden. Die jeweiligen Herstellerangaben sind zu beachten. 6.4 Reagenzien In allen Fllen sind analysereine, fr molekularbiologische Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen und Viren geeignete
45、 Reagenzien zu verwenden. Die Reagenzien werden nach den Angaben des Herstellers aufbewahrt. Es ist im Allgemeinen ratsam, Aliquote der fr ein PCR-Verfahren notwendigen Reaktionslsungen DIN 10135:2013-05 9 zu verwenden. Besondere Anforderungen von Reagenzien sind in DIN EN ISO 20838 und im Falle der
46、 Anwendung von Real-time-PCR-Verfahren in DIN EN ISO 22119 festgelegt. 7 Gerte 7.1 Allgemeines Smtliche Pipetten, Reaktionsgefe und Gerte mssen die Anforderungen nach DIN EN ISO 7218, DIN EN ISO 20837, DIN EN ISO 22119 und DIN EN ISO 22174 erfllen. Alle Glas- und Kunststoffgerte mssen vor Verwendung
47、 gereinigt, steril und frei von DNS sein. 7.2 Mikrobielle Anreicherung 7.2.1 Gerte zur Homogenisierung von Untersuchungsmaterial, vor Untersuchungsbeginn wird durch geeignete Manahmen sichergestellt, dass ein ausreichender Homogenisierungsgrad des Untersuchungs-materials erreicht wird. Dies kann je
48、nach Beschaffenheit der zu untersuchenden Probe durch thermische Verfahren (z. B. Aufschmelzen bei 37 C) oder mechanische Verfahren (z. B. Homogenisator, Mixgerte, Beutelwalkmischer) erreicht werden. 7.2.2 Brutschrnke oder Wasserbder, zum Bebrten der beimpften flssigen Nhrmedien, temperierbar auf 37
49、 C 1 C und ggf. auf 42 C 1 C 7.2.3 Kulturgefe, mit geeignetem Fassungsvermgen 7.2.4 Messpipetten, mit einem Pipettiervolumen von 10 ml bis 100 ml 7.3 Nukleinsureextraktion 7.3.1 Mikroliterpipetten, mit variabel einstellbaren Pipettiervolumina, z. B. 1 l bis 10 l, 10 l bis 100 l und 0,1 ml bis 1 ml 7.3.2 Tischzentrifuge, fr Mikroliter-Reaktionsgefe mit einem Volumen
