1、Dezember 2016DEUTSCHE NORM Preisgruppe 7DIN Deutsches Institut fr Normung e. V. Jede Art der Vervielfltigung, auch auszugsweise, nur mit Genehmigung des DIN Deutsches Institut fr Normung e. V., Berlin, gestattet.ICS 07.100.30!%R-“2584710www.din.deDIN 10161Mikrobiologische Untersuchung von Fleisch un
2、d Fleischerzeugnissen Bestimmung der aeroben Keimzahl bei 30 C TropfplattenverfahrenMicrobiological analysis of meat and meat products Aerobic count at 30 C Drop plating methodAnalyse microbiologique de la viande et des produits base de viande Dnombrement des germes arobies 30 C Mthode des plaques d
3、e gouttesAlleinverkauf der Normen durch Beuth Verlag GmbH, 10772 BerlinErsatz frDIN 10161-2:1984-02www.beuth.deGesamtumfang 10 SeitenDDIN-Normenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL)DIN 10161:2016-12 2 Inhalt Seite Vorwort 3 1 Anwendungsbereich . 4 2 Normative Verweisungen . 4
4、 3 Begriffe 4 4 Kurzbeschreibung . 4 5 Bezeichnung 5 6 Chemikalien und Nhrboden 5 6.1 Allgemeines . 5 6.2 Nhrmedium 5 6.3 Verdnnungslsungen . 6 6.4 Leistungsprfung zur Qualittssicherung der Nhrmedien 6 7 Gerte . 7 8 Probenahme 7 9 Durchfhrung 8 9.1 Vorbereitung der Verdnnungsrhrchen und -kolben . 8
5、9.2 Vorbereitung der Probe 8 9.3 Herstellung der Erstverdnnung . 8 9.4 Herstellung weiterer Dezimalverdnnungen . 8 9.5 Beimpfung 8 9.6 Bebrtung . 8 10 Auswertung 9 10.1 Zhlen der Kolonien . 9 10.2 Berechnung der Keimzahl 9 11 Untersuchungsbericht . 10 DIN 10161:2016-12 3 Vorwort Diese Norm wurde vom
6、 DIN-Normenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte“, Arbeitsausschuss NA 057-01-06 AA Mikrobiologie der Lebensmittelkette“ erarbeitet. Es wird auf die Mglichkeit hingewiesen, dass einige Elemente dieses Dokuments Patentrechte berhren knnen. DIN ist nicht dafr verantwortlich, einige o
7、der alle diesbezglichen Patentrechte zu identifizieren. nderungen Gegenber DIN 10161-2:1984-02 wurden folgende nderungen vorgenommen: a) Umbenennung in DIN 10161, weil 2015-09 DIN 10161-1:1984-02 ersatzlos zurckgezogen wurde; b) Aufnahme von Abschnitt 2 Normative Verweisungen“; c) Aufnahme von Absch
8、nitt 3 Begriffe“; d) Aufnahme des neuen Unterabschnitts 6.4 Leistungsprfung zur Qualittssicherung der Nhrmedien“; e) technische und redaktionelle berarbeitung sowie Ergnzungen zwecks Anpassung an die derzeit gltigen Gestaltungsregeln. Frhere Ausgaben DIN 10161-2: 1984-02 DIN 10161:2016-12 4 1 Anwend
9、ungsbereich Diese Norm legt ein Verfahren zur Bestimmung der Anzahl vegetativer, aerober Mikroorganismen nach der Tropfplatten-Technik fest. Das Verfahren ist anwendbar bei Fleisch und Fleischerzeugnissen sowie Erzeugnissen mit einem Zusatz von Fleisch und Fleischerzeugnissen. 2 Normative Verweisung
10、en Die folgenden Dokumente, die in diesem Dokument teilweise oder als Ganzes zitiert werden, sind fr die Anwendung dieses Dokuments erforderlich. Bei datierten Verweisungen gilt nur die in Bezug genommene Ausgabe. Bei undatierten Verweisungen gilt die letzte Ausgabe des in Bezug genommenen Dokuments
11、 (einschlielich aller nderungen). DIN EN ISO 6887-1, Mikrobiologie von Lebensmitteln und Futtermitteln Vorbereitung von Untersuchungs-proben und Herstellung von Erstverdnnungen und von Dezimalverdnnungen fr mikrobiologische Untersuchungen Teil 1: Allgemeine Regeln fr die Herstellung von Erstverdnnun
12、gen und Dezimal-verdnnungen DIN EN ISO 6887-2, Mikrobiologie von Lebensmitteln und Futtermitteln Vorbereitung von Untersuchungs-proben und Herstellung von Erstverdnnungen und von Dezimalverdnnungen fr mikrobiologische Untersuchungen Teil 2: Spezifische Regeln fr die Herstellung von Vorbereitung von
13、Fleisch und FleischerzeugnissenDIN EN ISO 11133, Mikrobiologie von Lebensmitteln, Futtermitteln und Wasser Vorbereitung, Herstellung, Lagerung und Leistungsprfung von Nhrmedien 3 Begriffe Fr die Anwendung dieses Dokuments gelten die folgenden Begriffe. 3.1 aerobe Mikroorganismen Mikroorganismen, die
14、 unter den in dieser Norm festgelegten aeroben Bedingungen wachsen 3.2 aerobe Keimzahl Anzahl der koloniebildenden Einheiten, die unter den in dieser Norm festgelegten aeroben Bedingungen wachsen 4 Kurzbeschreibung Agarplatten mit einem nicht selektiven Nhrboden werden in Sektoren aufgeteilt, die mi
15、t Teilmengen von jeweils 0,05 ml der unverdnnten, homogenisierten Probe oder der Erstverdnnung und der weiteren Ver-dnnungen tropfenweise beimpft werden. Bei einer Temperatur von 30 C wird unter aeroben Bedingungen 72 h bebrtet. Die Kolonien je Plattenausschnitt werden gezhlt (aerobe Koloniezahl) un
16、d auf die Anzahl der kolonie-bildenden Einheiten je g oder ml der Probe umgerechnet (aerobe Keimzahl). DIN 10161:2016-12 5 5 Bezeichnung Bezeichnung des Verfahrens zur Bestimmung der aeroben Keimzahl bei 30 C nach dieser Norm (B1): Prfung DIN 10161 B1 6 Chemikalien und Nhrboden 6.1 Allgemeines Die N
17、hrbodenbestandteile und Chemikalien mssen fr mikrobiologische Zwecke geeignet sein. Um vergleichbare Ergebnisse zu erhalten, wird empfohlen, eindeutig deklarierte Nhrbodenbestandteile und analysenreine Chemikalien oder Trockennhrbden zu verwenden. Den Anweisungen des Herstellers ist strikt zu folgen
18、. Das verwendete Wasser muss entweder destilliert oder entmineralisiert und mindestens von entsprechender Reinheit sein. Es darf keine Bestandteile enthalten, die das Wachstum von Mikroorganismen beeinflussen. 6.2 Nhrmedium 6.2.1 Keimzhlagar (en: Plate Count Agar, PCA) 6.2.2 Zusammensetzung Peptona5
19、,0 g Hefeextrakt 2,5 g Glucose, wasserfrei (C6H12O6) 1,0 g Agarb9 g bis 18 g Wasser 1 000 ml aZum Beispiel Casein, tryptisch verdaut. bAbhngig von der Gelfestigkeit des Agars. 6.2.3 Herstellung Die Nhrbodenbestandteile oder der Trockennhrboden werden in Wasser gelst. Der pH-Wert ist so einzustellen,
20、 dass er nach dem Sterilisieren bei 7,0 0,2 liegt, gemessen bei einer Temperatur von 25 C. Der Nhrboden wird in Kulturkolben bergefhrt und 15 min bei 121 C 1 C sterilisiert. 6.2.4 Herstellung der Agarplatten Teilmengen von etwa 15 ml des geschmolzenen Nhrbodens werden in sterile Petrischalen bergefh
21、rt und zum Verfestigen stehengelassen. Die Platten drfen fr bis zu 4 Wochen bei 5 C 3 C aufbewahrt werden. Unmittelbar vor der Verwendung werden die Platten mit der Agaroberflche nach unten, schrg auf dem abgenommenen Deckel liegend, in einem Brutschrank getrocknet, der auf eine Temperatur zwischen
22、25 C und 50 C eingestellt ist oder in einer Sicherheitswerkbank mit Laminarstrombelftung so lange, bis die Wassertrpfchen von der Oberflche des Mediums verschwunden sind. DIN 10161:2016-12 6 6.3 Verdnnungslsungen 6.3.1 Verdnnungslsung fr die Erstverdnnung Nach DIN EN ISO 6887-1. 6.3.2 Verdnnungslsun
23、g fr weitere Dezimalverdnnungen 6.3.2.1 Zusammensetzung Peptona1,0 g Natriumchlorid, NaCl 8,5 g Agar 0,75 g Wasser 1 000 ml aZum Beispiel Casein, tryptisch verdaut. 6.3.2.2 Herstellung Die einzelnen Bestandteile werden in Wasser gelst. Der pH-Wert ist so einzustellen, dass er nach dem Sterilisieren
24、bei 7,0 0,1 liegt. Wenn die Verdnnungslsung nicht unmittelbar nach der Herstellung ver-wendet wird, ist sie im Dunkeln und bei einer Temperatur zwischen 2 C und 8 C so aufzubewahren, dass keine Vernderungen des Volumens oder der Zusammensetzung eintreten knnen. Die Verdnnungslsung darf nicht lnger a
25、ls 1 Monat aufbewahrt werden. 6.4 Leistungsprfung zur Qualittssicherung der Nhrmedien Nach DIN EN ISO 11133. In der Tabelle 1 ist die Leistungsprfung fr Keimzhlagar nach 6.2.1 aufgefhrt. Tabelle 1 Leistungsprfung fr Keimzhlagar nach 6.2.1 Bebrtung Kontrollstmmea Referenz-Medium Prfverfahren Kriterie
26、n (72 3) h bei (30 1) C Escherichia coli WDCM 00012b, WDCM 00013 Bacillus subtilis subsp. spizizenii WDCM 00003b Staphylococcus aureus WDCM 00034TSAc Quantitativ Produktivitts-verhltnis (PR) 0,7 aBezugnehmend auf den Referenzstamm-Katalog, der (geprft am 29.09.2016) unter http:/www.wfcc.info bezglic
27、h der Kultur-Stammsammlungsnummer und der Kontaktdetails eingesehen werden kann; WDCM: World Data Centre for Microorganisms. bDurch das Laboratorium des Anwenders als Minimum zu verwendende Stmme. cTrypton-Soja-Agar. DIN 10161:2016-12 7 In der Tabelle 2 ist die Leistungsprfung fr die Verdnnungsflssi
28、gkeit fr weitere Dezimalverdnnungen nach 6.3.2 aufgefhrt. Tabelle 2 Leistungsprfung der Verdnnungsflssigkeit nach 6.3.2 Bebrtung Kontrollstmmea Referenz-Medium Prfverfahren Kriterien 45 min bis 1 h/20 C bis 25 C E. colibWDCM 00012 oder WDCM 00013 Staphylococcus aureusbWDCM 00034TSAc Quantitativ 50 %
29、 Kolonien/T0( 50 % der Ausgangskeim-zahl) aBezugnehmend auf den Referenzstamm-Katalog, der (geprft am 29.09.2016) unter http:/www.wfcc.info bezglich der Kultur-Stammsammlungsnummer und der Kontaktdetails eingesehen werden kann; WDCM: World Data Centre for Microorganisms. bDurch das Laboratorium des
30、Anwenders als Minimum zu verwendende Stmme. cTrypton-Soja-Agar. 7 Gerte 7.1 Allgemeines Alle Glasgerte mssen vor der Verwendung sorgfltig gereinigt und sterilisiert werden. Kunststoffgerte mssen steril sein. Zustzlich zu den in DIN EN ISO 6887-1 und DIN EN ISO 6887-2 aufgefhrten Gerten werden die Ge
31、rte nach 7.2 bis 7.6 bentigt. Mechanische Pipetten und andere Gerte fr die mechanisierte und automatisierte Durchfhrung der Arbeitsvorgnge drfen verwendet werden, sofern durch entsprechende Untersuchungen sichergestellt ist, dass vergleichbare Ergebnisse erzielt werden. 7.2 Brutschrank, einstellbar
32、auf 50 C. 7.3 Brutschrank, einstellbar auf 30 C 1 C. 7.4 Wasserbad, zum Khlen des Nhrbodens auf geeignete Temperaturen. 7.5 Petrischalen, Durchmesser etwa 90 mm. 7.6 Pipetten, geeignet zur Abgabe von 0,05 ml. 8 Probenahme Siehe DIN EN ISO 6887-2. DIN 10161:2016-12 8 9 Durchfhrung Die Zeitspanne vom
33、Beginn der Herstellung der Erstverdnnung nach 9.3 bis zur Beimpfung des Nhrmediums nach 9.5 darf 30 min nicht berschreiten. 9.1 Vorbereitung der Verdnnungsrhrchen und -kolben Nach DIN EN ISO 6887-1. 9.2 Vorbereitung der Probe Nach DIN EN ISO 6887-2. 9.3 Herstellung der Erstverdnnung Nach DIN EN ISO
34、6887-1. 9.4 Herstellung weiterer Dezimalverdnnungen Nach DIN EN ISO 6887-1. Abweichend von der genannten Norm wird zur Herstellung weiterer Dezimalverdnnungen die Verdnnungslsung nach 6.3.2 verwendet. 9.5 Beimpfung Mit einer sterilen Pipette werden Teilmengen von 0,05 ml der unverdnnten homogenisier
35、ten Probe oder der Erstverdnnung und der weiteren Verdnnungsstufen jeweils im Doppelansatz (gleiche Verdnnungsstufe auf verschiedene Platten) auf die auf der Plattenunterseite markierten Sektoren des Nhrbodens aufgetropft. Eine Platte darf fr maximal 6 Tropfen benutzt werden. Dabei ist mit der hchst
36、en Verdnnung zu beginnen. Bevor die Teilmengen auf die Sektoren bergefhrt werden, ist die Pipette dreimal zu fllen und zu leeren. Die Pipette wird dabei jeweils an der Innenwand des Behltnisses abgestreift, um anhaftendes lnokulum zu entfernen. Beim Auftropfen empfiehlt sich das Auftupfen der Pipett
37、enspitze auf die Agaroberflche, um die gesamte Menge des Inokulums auf den Nhrboden zu verbringen. Zur besseren Ausnutzung der zur Verfgung stehenden Nhrbodenflche sollte der Tropfen mit der Pipettenspitze ausgezogen werden. Nach dem Beimpfen bleiben die Platten so lange in der Waagerechten erschtte
38、rungsfrei stehen, bis das lnokulum angetrocknet ist. 9.6 Bebrtung Die Platten werden mit dem Boden der Petri-Schalen nach oben 72 h 2 h im Brutschrank bei einer Temperatur von 30 C bebrtet. Die Platten werden nach 24 h und 48 h kontrolliert und, soweit erforderlich, wird die Koloniezahl nach 10.1 er
39、mittelt. Die ausgezhlten Platten werden weiter bebrtet. DIN 10161:2016-12 9 10 Auswertung 10.1 Zhlen der Kolonien Nach Ablauf der Bebrtungszeit werden die Kolonien auf den zur Berechnung der Keimzahl heranzu-ziehenden Sektoren der Platten gezhlt. 10.2 Berechnung der Keimzahl Es werden diejenigen Sek
40、toren der Platten herangezogen, auf denen zwischen 1 bis 50 klar voneinander abgesetzte Kolonien gewachsen sind. Dabei muss aber mindestens eine Verdnnungsstufe Sektoren enthalten, auf denen zwischen 5 und 50 Kolonien vorliegen. Bei kleinen und gut auszhlbaren Kolonien drfen auch Sektoren mit bis zu
41、 100 Kolonien mit herangezogen werden. Aus den Koloniezahlen der niedrigsten und der nchsthheren auswertbaren Verdnnungsstufe wird der gewichtete Mittelwert verrechnet. Der Berechnung liegt folgende Zahlenwertgleichung zugrunde: =1 1 + 2 0,1Dabei ist der gewichtete Mittelwert der Koloniezahlen; die
42、Summe der Kolonien aller Sektoren, die zur Berechnung herangezogen werden (niedrigste und nchsthhere auswertbare Verdnnungsstufe); n1die Anzahl der Sektoren der niedrigsten auswertbaren Verdnnungsstufe; n2die Anzahl der Sektoren der nchsthheren Verdnnungsstufe. ANMERKUNG Auf der Platte entspricht di
43、e Impfmenge von 0,05 ml einer weiteren Verdnnung des Rhrchen- oder Kolbeninhalts von 1 : 20. Der Wert ist mit 20 zu multiplizieren. Die Keimzahl je g oder ml der Probe wird durch Multiplikation des -Wertes mit dem Verdnnungsfaktor erhalten. Das Ergebnis wird als Zahl zwischen 1,0 und 9,9 multiplizie
44、rt mit der entsprechenden Zehnerpotenz, angegeben. Dabei wird auf eine Dezimale gerundet. Dieser Wert ist das endgltige Ergebnis (siehe Berechnungsbeispiele 1 bis 4). Falls nur ein Sektor auswertbar ist, wird der Wert als betrachtet. Dieser Sachverhalt wird im Unter-suchungsbericht angegeben. Haben
45、sich auf den mit der grten Probenmenge beimpften Doppel-Sektoren jeweils weniger als 5 Kolonien gebildet, lautet das Ergebnis: a) bei unverdnnten homogenisierten Proben: Weniger als 1,0 102/ml“ b) bei verdnnten homogenisierten Proben: Weniger als 1,0 103/g“ Haben sich auf den mit der grten Probenmen
46、ge beimpften Doppel-Sektoren keine Kolonien gebildet, lautet das Ergebnis: a) bei unverdnnten homogenisierten Proben: Weniger als 2,0 101/ml“ b) bei verdnnten homogenisierten Proben: Weniger als 2,0 102/g“ DIN 10161:2016-12 10 11 Untersuchungsbericht Der Untersuchungsbericht muss mindestens die folg
47、enden Angaben enthalten: a) Verweisung auf diese Norm; b) Art, Herkunft und Bezeichnung der Probe; c) Art und Datum der Probenahme; d) Eingangs- und Untersuchungsdatum; e) Keimzahl je g bzw. je ml der Probe; f) gegebenenfalls Abweichungen von den Festlegungen dieser Norm; g) gegebenenfalls Angabe de
48、r Anzahl der ausgewerteten Sektoren. Berechnungsbeispiele: Beispiel 1 Verdnnungsstufe Beispiel 2 Verdnnungsstufe = 47,27 = 51,67 Ergebnis: 47,27 20 105= 9,5 107Ergebnis: 51,67 20 105= 1,0 108Beispiel 3 Verdnnungsstufe Beispiel 4 Verdnnungsstufe nicht auswertbar = 8,5 = 21,82 Ergebnis: 8,5 20 105= 1,7 107Ergebnis: 21,82 20 105= 4,4 107
