1、 DEUTSCHE NORMJuli 2010DIN 10198 ICS 07.100.30 Ersatz fr DIN 10198-1:1999-09 Mikrobiologische Milchuntersuchung Bestimmung prsumtiver Bacillus cereus Koloniezhlverfahren bei 37 C Microbiological analysis of milk Determination of presumptive Bacillus cereus Colony count technique at 37 C Analyse micr
2、obiologique du lait Dnombrement de Bacillus cereus prsums Mthode par comptage des colonies 37 C Gesamtumfang 11 SeitenNormenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL) im DIN DIN Deutsches Institut fr Normung e.V. Jede Art der Vervielfltigung, auch auszugsweise, nur mitGenehmigung
3、des DIN Deutsches Institut fr Normung e.V., Berlin gestattet. Alleinverkauf der Normen durch Beuth Verlag GmbH, 10772 Berlin Preisgruppe 8 www.din.de www.beuth.de !$ak“1627256DIN 10198:2010-07 Inhalt Seite Vorwort 3 1 Anwendungsbereich .4 2 Normative Verweisungen4 3 Begriffe .4 4 Kurzbeschreibung .4
4、 5 Nhrbden und Chemikalien 5 5.1 Allgemeines5 5.2 Nhrboden fr die Isolierung5 5.3 Verdnnungsflssigkeit6 5.4 Nhrbden fr die Hmolyseprfung 6 5.5 Farbstofflsungen und Waschreagenz fr die mikroskopische Identifizierung.7 6 Gerte und Hilfsmittel .8 7 Probenahme .8 8 Durchfhrung.8 8.1 Allgemeines8 8.2 Vor
5、bereitung der Probe (Anschttelung)8 8.3 Herstellung der Verdnnungen8 8.4 Beimpfung und Bebrtung .8 9 Auswertung 9 9.1 Zhlen der Kolonien 9 9.2 Mikroskopische Besttigung9 9.3 Hmolyseprfung 9 9.4 Berechnung und Angabe der Anzahl prsumtiver B. cereus .9 10 Untersuchungsbericht 10 Literaturhinweise 11 2
6、 DIN 10198:2010-07 Vorwort Diese Norm wurde vom Normenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte, Arbeitsausschuss Milch und Milchprodukte Probenahme- und Untersuchungsverfahren“, erarbeitet. Sie enthlt zustzliche nationale Festlegungen, die in dem als Europische Norm EN ISO 7932:2004 v
7、erffentlichten und entsprechend der bernahmeverpflichtung Europischer Normen als DIN EN ISO 7932:2005-03 ins nationale Normenwerk bernommenen horizontalen Verfahren zur Zhlung von prsumtiven Bacillus cereus nicht behandelt werden. Die Neuherausgabe von DIN EN ISO 7932 machte eine berarbeitung von DI
8、N 10198-1:1999-09 erforderlich. Diese Norm soll zusammen mit DIN EN ISO 7932:2005-03 gelten. nderungen Gegenber DIN 10198-1:1999-09 wurden folgende nderungen vorgenommen: a) fr die Bestimmung einer geringen Anzahl prsumtiver Bacillus cereus Verweis in Abschnitt 1 auf das MPN-Verfahren nach DIN EN IS
9、O 21871; b) Abschnitt Normative Verweisungen aktualisiert und einen Abschnitt Literaturhinweise neu aufgenommen; c) 5.2.2 zur Leistungsprfung fr die Qualittssicherung des Kulturmediums neu aufgenommen; d) in 9.3 auf die Hmolyseprfung nach DIN EN ISO 7932 verwiesen; e) Norm technisch und redaktionell
10、 berarbeitet und ergnzt und damit an die derzeit gltigen Gestaltungs-regeln angepasst. Frhere Ausgaben DIN 10198-1: 1992-08, 1999-09 3 DIN 10198:2010-07 1 Anwendungsbereich Diese Norm legt in Ergnzung zu DIN EN ISO 7932 ein Koloniezhlverfahren zur Bestimmung der Anzahl prsumtiver Bacillus cereus (im
11、 Folgenden kurz B. cereus genannt) bei 37 C unter Verwendung eines PEMBA-Agars als Nhrboden fr die Isolierung fest. Es ist fr Milch und Milcherzeugnisse sowie Speiseeis und Suglings- und Kleinkindernahrung auf Milchbasis anwendbar. Fr die Verwendung eines MYP-Agars als Nhrboden fr die Isolierung gel
12、ten die in DIN EN ISO 7932 getroffenen Festlegungen. ANMERKUNG Fr die Bestimmung einer geringen Anzahl prsumtiver B. cereus steht mit DIN EN ISO 21871 ein Verfahren der wahrscheinlichsten Keimzahl (MPN-Verfahren) mit selektiver Anreicherung zur Verfgung. 2 Normative Verweisungen Die folgenden zitier
13、ten Dokumente sind fr die Anwendung dieses Dokuments erforderlich. Bei datierten Verweisungen gilt nur die in Bezug genommene Ausgabe. Bei undatierten Verweisungen gilt die letzte Ausgabe des in Bezug genommenen Dokuments (einschlielich aller nderungen). DIN EN ISO 707, Milch und Milcherzeugnisse Le
14、itfaden zur Probenahme DIN EN ISO 7932, Mikrobiologie von Lebensmitteln und Futtermitteln Horizontales Verfahren zur Zhlung von prsumtivem Bacillus cereus Koloniezhlverfahren bei 30 C DIN EN ISO 8261, Milch und Milchprodukte Allgemeiner Leitfaden fr die Vorbereitung von Untersuchungsproben und die H
15、erstellung von Anschttelungen und Dezimalverdnnungen fr mikrobiologische Untersuchungen DIN ISO/TS 11133-2, Mikrobiologie von Lebensmitteln und Futtermitteln Anleitung fr die Vorbereitung und Herstellung von Nhrmedien Teil 2: Praktische Anleitung zur Leistungsprfung von Nhrmedien 3 Begriffe Fr die A
16、nwendung dieses Dokuments gilt der folgende Begriff. 3.1 prsumtiver Bacillus cereus B. cereus Mikroorganismus, der auf dem beschriebenen selektiven Nhrboden typische Kolonien bildet 4 Kurzbeschreibung Agarplatten mit Polymyxin-Pyruvat-Eigelb-Mannit-Bromthymolblau-Agar (PEMBA) werden mit jeweils 0,1
17、ml der Probe, der Anschttelung bzw. der weiteren Verdnnung beimpft und unter aeroben Bedingungen 18 h bis 48 h bei 37 C bebrtet. Fr prsumtive B. cereus typische Kolonien werden gezhlt. Falls weitergehende Untersuchungen notwendig erscheinen, mssen diese unter den in dieser Norm festgelegten Bedingun
18、gen positive Besttigungsreaktionen zeigen. Kolonien knnen mithilfe eines mikroskopischen Verfahrens oder der Hmolyseprfung besttigt werden. Aus der Anzahl typischer oder besttigter Kolonien wird die Anzahl an prsumtiven B.-cereus-Kolonien je g bzw. ml der Probe berechnet. 4 DIN 10198:2010-07 5 Nhrbd
19、en und Chemikalien 5.1 Allgemeines Chemikalien und Nhrbden mssen fr mikrobiologische Zwecke geeignet sein. Trockennhrbden mssen nach den Anweisungen des Herstellers zubereitet und verwendet werden. Das verwendete Wasser muss entweder in Glasgerten destilliert oder entmineralisiert und mindestens von
20、 entsprechender Reinheit sein. Es darf keine Bestandteile enthalten, die das Wachstum von Mikroorganismen beeinflussen. 5.2 Nhrboden fr die Isolierung 5.2.1 Polymyxin-Pyruvat-Eigelb-Mannit-Bromthymolblau-Agar (PEMBA) 5.2.1.1 Grundnhrboden 5.2.1.1.1 Zusammensetzung 1 g Caseinpepton, tryptisch verdaut
21、 (Trypton); 10 g D-Mannit; 10 g Natriumpyruvat; 0,1 g Magnesiumsulfat, MgSO4 7H2O; 2 g Natriumchlorid; 2,5 g Dinatriumhydrogenphosphat; 0,25 g Kaliumdihydrogenphosphat; 0,12 g Bromthymolblau; 10 g bis 15 g Agar (je nach Geliereigenschaften); 850 ml Wasser. 5.2.1.1.2 Herstellung Die einzelnen Bestand
22、teile werden durch Erhitzen und Schtteln vollstndig in Wasser gelst. Der Nhrboden wird 15 min bei (121 1) C sterilisiert. Der pH-Wert ist so einzustellen, dass er nach dem Sterilisieren bei (7,2 0,1) liegt, bezogen auf eine Temperatur von etwa 45 C. 5.2.1.2 Polymyxin-B-Sulfat-Lsung Nach DIN EN ISO 7
23、932. 5.2.1.3 Eigelb-Emulsion Nach DIN EN ISO 7932. 5 DIN 10198:2010-07 5.2.1.4 Vollstndiger Nhrboden 5.2.1.4.1 Zusammensetzung 850 ml Grundnhrboden nach 5.2.1.1; 100 ml Polymyxin-B-Sulfat-Lsung nach DIN EN ISO 7932; 50 ml Eigelb-Emulsion nach DIN EN ISO 7932. 5.2.1.4.2 Herstellung Der Grundnhrboden
24、wird geschmolzen und auf 45 C bis 47 C temperiert. Die ebenfalls auf 45 C temperierten anderen Bestandteile werden einzeln unter stndigem Rhren zugegeben. 5.2.1.5 Herstellen von Agarplatten Teilmengen von jeweils 12,5 ml des vollstndigen Nhrbodens werden in Petrischalen nach 6.1 bergefhrt und zum Ve
25、rfestigen stehen gelassen. Die fertigen Agarplatten sind bei einer Temperatur zwischen 0 C und 5 C aufzubewahren. Bei derartiger Lagerung sind die Agarplatten bis vier Tage verwendbar. Vor der Verwendung werden die Agarplatten getrocknet. 5.2.2 Leistungsprfung fr die Qualittssicherung des Kulturmedi
26、ums Bezglich der Definition der Parameter Produktivitt und Selektivitt wird auf DIN ISO/TS 11133-2 verwiesen. Die Kriterien fr die Leistungsprfung von Polymyxin-Pyruvat-Eigelb-Mannit-Bromthymolblau-Agar (PEMBA) finden sich in Tabelle 1. Tabelle 1 Leistungsprfung von Polymyxin-Pyruvat-Eigelb-Mannit-B
27、romthymolblau-Agar (PEMBA) Funktion Inkubation Kontrollstmme Prf-verfahren Kriterien Charakteris-tische Reaktionen Produktivitt 18 h bis 48 h bei 37 C B. cereus ATCC 11778 oder der gleiche Stamm aus einer anderen Sammlung qualitativ gutes Wachstum blaue bis blaugrne Kolonien mit Przipitathof Selekti
28、vitt 48 h bei 37 C E. coli ATCC 25922 oder 8739 oder der gleiche Stamm aus einer anderen Sammlung qualitativ vllige Hemmung 5.3 Verdnnungsflssigkeit Als Verdnnungsflssigkeit werden viertelstarke Ringerlsung oder Kochsalz-Pepton-Lsung nach DIN EN ISO 8261 verwendet. 5.4 Nhrbden fr die Hmolyseprfung N
29、ach DIN EN ISO 7932. 6 DIN 10198:2010-07 5.5 Farbstofflsungen und Waschreagenz fr die mikroskopische Identifizierung 5.5.1 Malachitgrn-Lsung 5.5.1.1 Zusammensetzung 5 g Malachitgrn-Oxalat; 100 ml Wasser. 5.5.1.2 Herstellung Das Malachitgrn wird in Wasser gelst. 5.5.2 Sudanschwarz-B-Lsung 5.5.2.1 Zus
30、ammensetzung 0,3 g Sudanschwarz B; 100 ml Ethanol, Volumenanteil 70 %. 5.5.2.2 Herstellung Das Sudanschwarz B wird in Ethanol gelst. 5.5.3 Xylol (Waschreagenz) 5.5.4 Safranin-Lsung 5.5.4.1 Zusammensetzung 0,5 g Safranin; 100 ml Wasser. 5.5.4.2 Herstellung Das Safranin wird in Wasser gelst. 7 DIN 101
31、98:2010-07 6 Gerte und Hilfsmittel 6.1 Allgemeines Nach DIN EN ISO 7932. Alle Gerte und Hilfsmittel mssen vor der Verwendung sorgfltig gereinigt und sterilisiert werden. Kunststoffgerte mssen steril sein. Mechanische Pipetten und andere Gerte fr die mechanisierte und automatisierte Durchfhrung der A
32、rbeitsgnge drfen verwendet werden, sofern durch entsprechende Untersuchungen sichergestellt ist, dass vergleichbare Ergebnisse erzielt werden. Zustzlich zu den in DIN EN ISO 7932 aufgefhrten Gerten werden die Gerte und Hilfsmittel nach 6.2 und 6.3 bentigt. 6.2 Mikroskop mit limmersionsobjektiv, z. B
33、. Labormikroskop. 6.3 Objekttrger aus Glas, etwa 76 mm 26 mm. 7 Probenahme Die Probenahme wird nach DIN EN ISO 707 durchgefhrt. 8 Durchfhrung 8.1 Allgemeines Die Zeitspanne vom Beginn der Herstellung der Anschttelung nach 8.2 bis zur Beimpfung des Nhrbodens nach 8.4 darf 30 min nicht berschreiten. 8
34、.2 Vorbereitung der Probe (Anschttelung) Je nach Art der Probe nach DIN EN ISO 8261. 8.3 Herstellung der Verdnnungen Die Verdnnungsstufen werden so gewhlt, dass Agarplatten mit etwa 50 Kolonien erwartet werden knnen. Mindestens 1 ml der nach 8.2 vorbereiteten Probe wird zu der neunfachen Menge Verdn
35、nungsflssigkeit hinzugefgt (Ausgangssuspension). Hhere Verdnnungsstufen (Dezimalverdnnungen) werden jeweils durch Hinzufgen von 1 ml der vorhandenen Verdnnung zu 9 ml Verdnnungsflssigkeit hergestellt. Fr jede Verdnnungsstufe ist eine gesonderte Pipette zu verwenden. Die Verdnnungen werden jeweils un
36、mittelbar vor der weiteren Verarbeitung grndlich gemischt. 8.4 Beimpfung und Bebrtung Nach DIN EN ISO 7932. Davon abweichend werden die beimpften Platten bei 37 C bebrtet. Ist eine weitere Bebrtung erforderlich, darf diese auch bei Zimmertemperatur erfolgen. 8 DIN 10198:2010-07 9 Auswertung 9.1 Zhle
37、n der Kolonien Nach Abschluss der Bebrtung werden typische Kolonien ausgezhlt. Dabei werden nur Platten berck-sichtigt, die nicht mehr als etwa 50 Kolonien aufweisen. Typische Kolonien prsumtiver B. cereus sind etwa 2 mm bis 5 mm gro, zeigen einen unregelmigen gekerbten bis wurzelartigen Rand, eine
38、blaue bis blaugrne Farbe, eventuell mit einem grauweien Zentrum der Kolonie und weisen einen bis 5 mm breiten Przipitathof (Eigelbreaktion) auf. In der Regel ist eine mikroskopische Besttigung oder eine Besttigung mithilfe der Hmolyseprfung bei typischen Kolonien nicht erforderlich. Falls Platten ei
39、nen hohen Gehalt an mannitvergrenden Begleitkeimen aufweisen, kann die charakteristische Frbung der Kolonien und des Hintergrundes abgeschwcht bzw. nicht mehr sichtbar sein. Einige prsumtive B.-cereus-Stmme zeigen auerdem nur eine schwache oder gar keine Eigelbreaktion. In diesen sowie in allen ande
40、ren zweifelhaften Fllen sind verdchtige Kolonien durch mikroskopische Prfung und/oder Hmolyseprfung zu besttigen. 9.2 Mikroskopische Besttigung 9.2.1 Auswahl und Reinigung von Kolonien Die Besttigung zweifelhafter Kolonien kann mithilfe einer mikroskopischen Untersuchung durchgefhrt werden. Hierzu s
41、ind von jeder Platte, die zur Zhlung oder Reinigung nach 9.1 herangezogen wurde, drei Kolonien auszuwhlen. 9.2.2 Frbung Bei 24 h alten Kulturen wird von der Mitte der Kolonie, bei lteren Kulturen von der Peripherie mit einer se etwas Material auf einem entfetteten Objekttrger in einen kleinen Tropfe
42、n Wasser verrieben, luftgetrocknet und hitzefixiert. Anschlieend werden die Sporen ber kochendem Wasser mit Malachitgrn-Lsung nach 5.5.1 angefrbt. Nach 2 min wird berschssiger Farbstoff mit Wasser abgesplt, der Objekttrger getrocknet und mit Sudanschwarz-B-Lsung nach 5.5.2 berschichtet (Frbung intra
43、zellulren Fettes). Nach 15 min Einwirkungszeit wird mit Xylol nach 5.5.3 gewaschen, dann mit Filterpapier getrocknet und anschlieend mit Safranin-Lsung nach 5.5.4 erneut gefrbt (Frbung der Sporangien). Nach 20 s wird berschssiger Farbstoff abgegossen, mit Wasser nachgesplt und luftgetrocknet. 9.2.3
44、Mikroskopische Untersuchung Die Objekttrger werden im Mikroskop mit Immersionsl untersucht. Die in der Regel backsteinfrmigen und in Ketten angeordneten Zellen prsumtiver B. cereus sind 4 m bis 5 m lang, 1 m bis 1,5 m breit und weisen grere Mengen intrazellulren, schwarz angefrbten Fettes auf. Die g
45、rn angefrbte Spore kann zentral oder subterminal liegen, treibt aber in keinem Fall das rot gefrbte Sporangium auf. 9.3 Hmolyseprfung Nach DIN EN ISO 7932. 9.4 Berechnung und Angabe der Anzahl prsumtiver B. cereus Nach DIN EN ISO 7932. 9 DIN 10198:2010-07 10 Untersuchungsbericht Im Untersuchungsberi
46、cht sind unter Verweis auf diese Norm mindestens anzugeben: a) Art, Herkunft und Bezeichnung der Probe; b) Art und Datum der Probenahme; c) Eingangs- und Untersuchungsdatum; d) Anzahl prsumtiver B.-cereus-Kolonien je ml bzw. g der Probe; e) gegebenenfalls Abweichungen von den Festlegungen dieser Nor
47、m. 10 DIN 10198:2010-07 11 Literaturhinweise DIN EN ISO 7218, Mikrobiologie von Lebensmitteln und Futtermitteln Allgemeine Anforderungen und Leitlinien fr mikrobiologische Untersuchungen DIN V ENV ISO 11133-1, Mikrobiologie von Lebensmitteln und Futtermitteln Anleitung fr die Zubereitung und Herstel
48、lung von Nhrmedien Teil 1: Allgemeine Anleitungen fr die Qualittssicherung bei der Zubereitung von Nhrmedien im Laboratorium DIN EN ISO 21871, Mikrobiologie von Lebensmitteln und Futtermitteln Horizontales Verfahren zur Bestimmung niedriger Zahlen von prsumtivem Bacillus cereus Verfahren der wahrscheinlichsten Keimzahl (MPN) und Nachweisverfahren
