1、Dezember 2007DEUTSCHE NORM Normenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL) im DINPreisgruppe 9DIN Deutsches Institut fr Normung e.V. Jede Art der Vervielfltigung, auch auszugsweise, nur mit Genehmigung des DIN Deutsches Institut fr Normung e.V., Berlin, gestattet.ICS 67.100.01!$H
2、t“1378158www.din.deDDIN 10326Milcherzeugnisse und Speiseeis Bestimmung des Gehaltes an Saccharose und Glucose Enzymatisches VerfahrenMilk products and ice cream Determination of sucrose and glucose content Enzymatic methodProduits laitiers et glace Dtermination de la teneur en saccharose et en gluco
3、se Mthode enzymatiqueAlleinverkauf der Normen durch Beuth Verlag GmbH, 10772 BerlinErsatz frDIN 10326:1986-02www.beuth.deGesamtumfang 12 SeitenDIN 10326:2007-12 2 Inhalt Seite Vorwort . 3 1 Anwendungsbereich 4 2 Normative Verweisungen. 4 3 Begriffe 4 4 Kurzbeschreibung 4 5 Chemikalien. 5 6 Gerte. 6
4、7 Probenahme 6 8 Durchfhrung 7 9 Auswertung . 8 10 Untersuchungsbericht . 11 Literaturhinweise . 12 DIN 10326:2007-12 3 Vorwort Diese Norm wurde vom Normenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte, Arbeitsausschuss Milch und Milchprodukte Probenahme- und Untersuchungsverfahren“ erarbei
5、tet. nderungen Gegenber DIN 10326:1986-02 wurden folgende nderungen vorgenommen: a) der Titel wurde klarer strukturiert; b) die Vorschrift zur Probenvorbereitung wurde allgemeiner gefasst; c) die Berechnungsformel wurde korrigiert; d) die Przisionsdaten wurden redaktionell korrigiert (anstelle R war
6、 sRangegeben worden); e) die Norm wurde technisch und redaktionell berarbeitet und ergnzt und damit an die derzeit gltigen Gestaltungsregeln angepasst. Frhere Ausgaben DIN 10326: 1971-05, 1986-02 DIN 10326:2007-12 4 1 Anwendungsbereich Diese Norm legt ein enzymatisches Verfahren zur Bestimmung des G
7、ehaltes an Saccharose und Glucose in Milcherzeugnissen und Speiseeis fest. 2 Normative Verweisungen Die folgenden zitierten Dokumente sind fr die Anwendung dieses Dokuments erforderlich. Bei datierten Verweisungen gilt nur die in Bezug genommene Ausgabe. Bei undatierten Verweisungen gilt die letzte
8、Ausgabe des in Bezug genommenen Dokuments (einschlielich aller nderungen). DIN EN ISO 707, Milch und Milchprodukte Leitfaden zur Probenahme 3 Begriffe Fr die Anwendung dieses Dokuments gelten die folgenden Begriffe. 3.1 Saccharosegehalt der nach dieser Norm bestimmte Massenanteil an Saccharose in Mi
9、lcherzeugnissen und Speiseeis, angege-ben in Gramm je 100 Gramm der Probe 3.2 Glucosegehalt der nach dieser Norm bestimmte Massenanteil an Glucose in Milcherzeugnissen und Speiseeis, angegeben in Gramm je 100 Gramm der Probe 4 Kurzbeschreibung In dem von Fett und Eiwei befreiten, wssrigen Extrakt de
10、r Probe wird Saccharose durch das Enzym -Fructosidase zu Glucose und Fructose gespalten. Glucose wird in Gegenwart des Enzyms Hexokinase (HK) durch Adenosin-5-triphosphat (ATP) zu Glucose-6-phosphat (G-6-P) phosphoryliert, welches anschlieend in Gegenwart des Enzyms Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase
11、(G6P-DH) durch Nicotinamid-adenin-dinucleotidphosphat (NADP) zu Gluconat-6-phosphat oxidiert wird. Die Menge der bei dieser Reaktion gebildeten reduzierten Form des Nicotinamid-adenin-dinucleotidphosphats (NADPH) wird durch Messung des Extinktionsanstiegs der Probenlsung bei 340 nm (alternativ 334 n
12、m oder 365 nm) bestimmt und ist der gesamten im Testansatz vorhandenen Glucose (aus Saccharose stammende Glucose und freie Glucose) proportional. In einem Parallelansatz wird die vorhandene freie Glucose ohne vorherige Spaltung der Saccharose durch -Fructosidase in gleicher Weise durch Phosphorylier
13、ung und Oxidation zu Gluconat-6-phospat bestimmt. Die Differenz der Extinktionen zwischen den Prfanstzen mit und ohne Katalyse durch -Fructosidase ist propor-tional der aus Saccharose freigesetzten Glucose und somit auch dem Saccharosegehalt der Probe. Die Bestimmung basiert somit auf folgenden Reak
14、tionsprinzipien: Saccharose + H2O seFructosida-Glucose + Fructose Glucose + ATP (Adenosin-5-triphosphat) HKG-6-P + ADP (Adenosin-5-diphosphat) G-6-P + NADP+DH-G6PGluconat-6-phosphat + NADPH + H+DIN 10326:2007-12 5 5 Chemikalien 5.1 Allgemeines Sofern nicht anders angegeben, sind analysenreine Chemik
15、alien zu verwenden. Das zur Herstellung der Probenlsung verwendete Wasser muss mindestens die Reinheit von destilliertem Wasser haben. Zur Her-stellung der Enzym- und Coenzymlsungen sowie der Pufferlsungen ist frisch bidestilliertes Wasser zu verwenden. 5.2 Kaliumhexacyanoferrat(II)-Lsung, Massenkon
16、zentration (K4Fe(CN)6 3 H2O) = 36 g/l 3,6 g Kaliumhexacyanoferrat(II)-Trihydrat werden mit Wasser zu 100 ml gelst. 5.3 Zinksulfat-Lsung, Massenkonzentration (ZnSO4 7 H2O) = 72 g/l 7,2 g Zinksulfat-Heptahydrat werden mit Wasser zu 100 ml gelst. 5.4 Natronlauge, Stoffmengenkonzentration c(NaOH) = 2 mo
17、l/l 8 g Natriumhydroxid werden mit Wasser zu 100 ml gelst. 5.5 Citrat-Pufferlsung, pH = 4,6 3,45 g Citronensure-Monohydrat (C6H8O7 H2O) und 4,55 g Trinatriumcitrat-Dihydrat (C6H5Na3O7 2 H2O) werden in 70 ml bidestilliertem Wasser gelst. Der pH-Wert wird mit Natronlauge (5.4) auf 4,6 eingestellt und
18、die Lsung mit bidestilliertem Wasser auf 100 ml aufgefllt. Die Lsung ist bei 4 C etwa 1 Jahr haltbar. 5.6 -Fructosidase-Lsung, aus Hefe (EC 3.2.1.26)1)1; Lyophilisat mit 300 U/mg ( 5 000 mkat/kg)2). 5 mg -Fructosidase werden mit 2 ml bidestilliertem Wasser gelst (750 U/ml 12,5 kat/ml)2). Diese Lsung
19、 ist bei 4 C etwa 1 Woche haltbar. 5.7 Triethanolamin-Pufferlsung, pH = 7,6 14,0 g Triethanolamin-Hydrochlorid (C6H15NO3 HCl) und 0,25 g Magnesiumsulfat (MgSO4 7 H2O) werden in 70 ml bidestilliertem Wasser gelst. Der pH-Wert wird mit Natronlauge (5.4) auf 7,6 eingestellt und die Lsung mit bidestilli
20、ertem Wasser auf 100 ml aufgefllt. Die Lsung ist bei 4 C etwa 4 Wochen haltbar. 5.8 Nicotinamid-adenin-dinucleotidphosphat-Lsung (NADP), Massenkonzentration (NADP-Na2) = 10 g/l 60 mg -NADP-Dinatriumsalz (Massenanteil w 98 %) werden in 6 ml bidestilliertem Wasser gelst. Die L-sung ist bei 4 C etwa 4
21、Wochen haltbar. 5.9 Adenosin-5-triphosphat-Lsung (ATP), Massenkonzentration (ATP-Na2H2 3 H2O) = 50 g/l 300 mg ATP-Trihydrat (w 100 %) und 300 mg Natriumhydrogencarbonat (NaHCO3) werden in 6 ml bidestil-liertem Wasser gelst. Die Lsung ist bei 4 C etwa 4 Wochen haltbar. 1) en: Enzyme Commission Number
22、 DIN 10326:2007-12 6 5.10 Hexokinase-Suspension (HK), aus Hefe (EC 2.7.2.1); Kristallsuspension, = 2 mg/ml in Ammonium-sulfat-Lsung (c = 3,2 mol/l), 140 U/mg ( 2 333 mkat/kg)2). Die Suspension ist bei 4 C etwa 1 Jahr haltbar. 5.11 Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase-Suspension (G6P-DH), aus Hefe (EC 1.
23、1.1.49); Kristallsus-pension, = 1 mg/ml in Ammoniumsulfat-Lsung (c = 3,2 mol/l, 140 U/mg ( 2 333 mkat/kg)2). Die Sus-pension ist bei 4 C etwa 1 Jahr haltbar. Fr die enzymatische Bestimmung befinden sich Fertigreagenzien im Handel, bei deren Verwendung die Arbeitsvorschrift des Herstellers zu bercksi
24、chtigen ist. 6 Gerte 6.1 Analysenwaage, Skalenteilungswert 0,1 mg 6.2 Spektralphotometer, geeignet zum Messen bei 340 nm ANMERKUNG Es drfen auch Spektralphotometer, die eine Messung bei 365 nm bzw. 334 nm mit Hg-Lampen ge-statten, verwendet werden. 6.3 Messkvetten aus Glas oder Kunststoff, Schichtdi
25、cke 10,0 mm Bei Verwendung von Kunststoffkvetten ist darauf zu achten, dass sich der Absorptionskoeffizient des Kunst-stoffmaterials der Kvetten unter Einstrahlung der UV-Lichtquelle des Photometers nicht verndert. 6.4 Faltenfilter, Nenndurchmesser 150 mm, mittelschnell filtrierend 6.5 Becherglas, N
26、ennvolumen 100 ml oder Erlenmeyerkolben, Nennvolumen 100 ml 6.6 Messkolben, Nennvolumen 100 ml 6.7 Pipetten, zur enzymatischen Analyse geeignet, Nennvolumen 2 ml, 1 ml, 200 l, 100 l, 20 l, 10 l 6.8 pH-Messeinrichtung mit Elektrode und Magnetrhrer; heizbar, falls nach 8.3.1 erforderlich. 6.9 Magnetrh
27、rer 7 Probenahme Nach DIN EN ISO 707. 2) Die Enzymaktivitt wird in Deutschland blicherweise noch in Internationalen Einheiten (U) angegeben. 1 U ist die Enzymaktivitt, die bei einer Enzymtemperatur von 25 C unter optimalen Bedingungen eine Substratmenge von 1 mol Substrat je min umsetzt. Die vorgesc
28、hriebene SI-Einheit der Enzymaktivitt ist das Katal (kat). 1 kat ist die Enzymaktivitt, die unter optimalen Bedingungen 1 mol Substrat je Sekunde umsetzt. 1 U entspricht zahlenmig 16,67 nkat. DIN 10326:2007-12 7 8 Durchfhrung 8.1 Vorbereitung der Probe Die Probe wird so gut durchmischt, dass die Ent
29、nahme einer reprsentativen Teilmenge fr die Untersuchung mglich ist. 8.2 Probeneinwaage Im enzymatischen Reaktionsansatz sollte die Saccharose- bzw. Glucose-Konzentration so hoch sein, dass sich eine Extinktionsdifferenz E von mindestens 0,1 und maximal etwa 1,0 ergibt. Dies erfordert eine Sac-charo
30、semenge von 16 g bis 160 g oder Glucosemenge von 8 g bis 80 g (Messwellenlnge 340 nm oder 334 nm) bzw. eine Saccharosemenge von 30 g bis 300 g oder Glucosemenge von 15 g bis 150 g (Mess-wellenlnge 365 nm) im Kvetten-Testansatz (V1nach 8.4: 3,54 ml). Um dies zu erreichen, knnen die Ein-waage der Prob
31、e, das Endvolumen der Probelsung nach Klrung (V3, nach 8.3.4 nach Vorgabe 100 ml, kann hher gewhlt werden) und das in den enzymatischen Messansatz gebrachte Volumen der Probelsung (V2, nach 8.4 nach Pipettierschema 0,1 ml, Volumen kann bis auf 2,0 ml erhht werden) variiert werden. Folgende Randbedin
32、gungen der Einwaage sind zu beachten: die Probeneinwaage sollte mglichst nicht kleiner als 1 g sein (Reprsentativitt der Einwaage, Przision der Bestimmung); die Trockenmasse der Einwaage sollte etwa 3 g nicht bersteigen (einwandfreie Klrung). Gegebenenfalls ist bei hohen Saccharose- bzw. Glucosekonz
33、entrationen der Probe ein zustzlicher Verdn-nungsschritt vorzunehmen. Werden die Normalbedingungen des Verfahrens eingehalten (V2= 0,1 ml, V3= 100 ml), kann bei einem Sac-charosegehalt (Massenanteil) der Probe im Bereich von 2 % bis 10 % bzw. Glucosegehalt (Massenanteil) von 1 % bis 5 % eine Probene
34、inwaage von 2 g gewhlt werden. 8.3 Herstellen der Probenlsung 8.3.1 Die Probe wird auf 1 mg in ein 100-ml-Becherglas oder einen 100-ml-Erlenmeyerkolben (6.5) eingewogen. Es werden etwa 50 ml Wasser zugesetzt und mit der Probe gut gemischt. Bei Proben mit einem hohen Saccharosegehalt, in denen die Sa
35、ccharose zum Teil in nicht gelster, kristalliner Form vorliegt (z. B. gezuckerte Kondensmilch, Speiseeis) wird das Probe-Wassergemisch etwa 10 min bei 40 C bis 60 C bis zur vollstndigen Lsung der Saccharose gerhrt (Magnetrhrer). 8.3.2 Gegebenenfalls nach Entfernen des Rhrmagneten werden nacheinander
36、 5,0 ml Kaliumhexacyano-ferrat(II)-Lsung (5.2) und 5,0 ml Zinksulfat-Lsung (5.3) zugegeben. Nach jeder Zugabe wird krftig durch-geschttelt. 8.3.3 Die Mischung wird mit etwa 2 ml Natronlauge (5.4) mittels pH-Messeinrichtung (6.8) auf einen pH-Wert zwischen 7,0 und 7,5 eingestellt. 8.3.4 Der Inhalt de
37、s Becherglases bzw. des Erlenmeyerkolbens wird quantitativ in einen 100-ml-Mess-kolben (6.6) bergefhrt. Dieser wird mit Wasser bis zur Marke aufgefllt. Anschlieend wird der Inhalt gemischt. 8.3.5 Der Inhalt des Messkolbens wird durch ein trockenes Faltenfilter (6.4) filtriert. Falls erforderlich, wi
38、rd nochmals filtriert, bis sich ein weitgehend klares bis leicht opaleszierendes Filtrat ergibt. Das Filtrat wird zur Bestimmung nach 8.4 verwendet. Je nach Konzentration des Analyten in der Probe muss die Probenlsung unter Umstnden weiter verdnnt werden (nach 8.2). In diesen Fllen ist der Verdnnung
39、sfaktor F bei der Berechnung zu bercksichtigen. DIN 10326:2007-12 8 8.4 Bestimmung Die Bestimmung ist bei etwa 20 C durchzufhren. Das Absorptionsmaximum von NADPH liegt bei 340 nm; diese Wellenlnge ist somit bei Spektralphotometern zu bevorzugen. Bei Verwendung eines Spektrallinien-Filterphotometers
40、 mit Quecksilberdampflampe wird bei einer Wellenlnge von 334 nm oder 365 nm gemessen. Die Messung der Absorptionen sollte grundstzlich gegen Luft erfolgen. Die Dosierung der einzelnen Reagenzien sowie der Ablauf der Bestimmung sind der Tabelle 1 zu entnehmen. Die Bestimmungen des Leerwertes, der fre
41、ien Glucose und der Saccharose erfolgen parallel. Wird das Probelsungsvolumen V2gegenber dem Pipettierschema (0,1 ml) erhht, ist die zugegebene Was-sermenge entsprechend zu verringern (Volumen Probelsung + Volumen Wasser = 2,00 ml). Ist nach Abschluss der Hauptreaktion eine konstante Extinktionszuna
42、hme zu verzeichnen (unspezifische Schleichreaktion), wird die letzte Extinktion (E2) jeweils auf den Zeitpunkt der Zugabe der Hexokinase-Sus-pension extrapoliert. Tabelle 1 Pipettierschema In Kvetten pipettieren Glucose Saccharose Leerwert Probenansatz Leerwert Probenansatz Citrat-Pufferlsung (5.5)
43、0,20 ml 0,20 ml -Fructosidase-Lsung (5.6) 0,02 ml 0,02 ml Probenlsung (8.3.5) 0,10 ml 0,10 ml Mischen, etwa 15 min stehen lassen, Zugabe von Triethanol-Pufferlsung (5.7) 1,00 ml 1,00 ml 1,00 ml 1,00 ml NADP-Lsung (5.8) 0,10 ml 0,10 ml 0,10 ml 0,10 ml ATP-Lsung (5.9) 0,10 ml 0,10 ml 0,10 ml 0,10 ml W
44、asser 2,32 ml 2,22 ml 2,10 ml 2,00 ml Mischen, nach etwa 3 min Extinktionen der Lsungen gegen Luft messen (E1), Zugabe von HK-Suspension (5.10) 0,01 ml 0,01 ml 0,01 ml 0,01 ml G6P-DH-Suspension (5.11) 0,01 ml 0,01 ml 0,01 ml 0,01 ml Mischen, etwa 15 min stehen lassen, Extinktionen der Lsungen gegen
45、Luft messen (E2). Nach 2 min erneut messen. Zeigt sich dabei, dass die Reaktion nicht zum Stillstand gekommen ist, werden die Extinktionen in 2-min-Abstnden gemessen, bis eine konstante Extinktionszunahme erreicht ist. 9 Auswertung 9.1 Berechnung Es werden folgende Extinktionsdifferenzen berechnet:
46、)()Leerwert-oseGluc12Messlsung-oseGluc12GEEEEE = )()Leerwert-Saccharose12Messlsung-Saccharose12osecGesamtgluEEEEE = DIN 10326:2007-12 9 Die durch die Hydrolyse der Saccharose verursachte Extinktionsnderung wird nach folgender Gleichung be-rechnet: GlucoseoseGesamtglucSEEE = Der Saccharosegehalt, wS,
47、 wird als Massenanteil in Gramm je 100 Gramm der Probe nach Gleichung (1) be-rechnet: 00010231SSs=mVdFVVMEw(1) Dabei ist ESdie Extinktionsnderung, die durch die durch Hydrolyse der Saccharose freigesetzte Glucose ver-ursacht wurde; MS die relative molare Masse von Saccharose, MS= 342,3 g/mol; der mo
48、lare Extinktionskoeffizient von NADPH in Liter je Millimol je Zentimeter bei: = 340 nm: = 6,3 l mmol1 cm1; = 365 nm (Hg): = 3,5 l mmol1 cm1; = 334 nm (Hg): = 6,18 l mmol1 cm1; D die Schichtdicke der Kvette, in Zentimeter; hier: d = 1,00 cm; V1das Volumen des Messansatzes, in Milliliter (nach Tabelle 1 ist V1= 3,54 ml); V2das Volumen der Probenlsung nach 8.3.5 im Messansatz, in Milliliter (nach Tabelle 1 ist V2= 0,100 ml); V3das Volumen, auf das die Probe nach 8.3.4 aufgefllt wurde, in Milliliter (nach 8.3.4 ist V3= 100 ml); M die Einwaage der Probe, in Gramm; F der Verdnnungsfakt
