DIN 10466-2001 Determination of whey protein content in total protein of milk and milk products - Polarographic method《牛奶和牛奶制品总蛋白质的乳清蛋白质含量测定 极谱法》.pdf

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1、DEUTSCHE NORM September 2001Bestimmung des Molkenproteinanteils imGesamtprotein von Milch und MilchproduktenPolarographisches Verfahren10466ICS 67.100.01Ersatz frDIN 10466:1994-02Determination of whey protein content in total protein of milk and milk products Polarographic methodDtermination de la t

2、eneur en protines du serum dans les protinestotales du lait et des produits laitiers Mthode polarographiqueVorwortDiese Norm wurde vom Normenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte, Arbeitsaus-schuss Chemische und physikalische Milchuntersuchung“, erarbeitet.nderungenGegenber DIN 104

3、66:1994-02 wurden folgende nderungen vorgenommen:a) Die Anforderungen an die zu verwendenden Chemikalien wurden zum Teil neu gefasst.b) Die normativen Verweisungen wurden aktualisiert.c) Die Norm wurde gestalterisch den gltigen Regeln fr den Aufbau und die Abfassung von DIN-Normenangeglichen.Frhere

4、AusgabenDIN 10466: 1994-02Fortsetzung Seite 2 bis 10Normenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL)im DIN Deutsches Institut fr Normung e. V. DIN Deutsches Institut fr Normung e.V. .Jede Art der Vervielfltigung, auch auszugsweise, Ref. Nr. DIN 10466:2001-09nur mit Genehmigung des

5、 DIN Deutsches Institut fr Normung e. V., Berlin, gestattet. Preisgr. 07 Vertr.-Nr. 0007Alleinverkauf der Normen durch Beuth Verlag GmbH, 10772 BerlinSeite 2DIN 10466:2001-091 AnwendungsbereichDiese Norm legt ein Verfahren zur polarographischen Bestimmung des Molkenproteinanteils im Gesamt-protein v

6、on Milch und Milchprodukten fest.WARNUNG Bei dem Verfahren ist das toxische Methylquecksilberchlorid als Reagenz erforder-lich. Deshalb sollte diese Norm nur dann eingesetzt werden, wenn, wie z. B. bei gereiftem Kse, daselektrophoretische Verfahren nach DIN 10472 nicht anwendbar ist oder es aus ande

7、ren Grndennicht durchgefhrt werden kann.ANMERKUNG Die mit diesem Verfahren ermittelten Werte fr den Molkenproteinanteil im Gesamtprotein sind mitden mit DIN 10472 ermittelten Ergebnissen vergleichbar.2 Normative VerweisungenDiese Norm enthlt durch datierte oder undatierte Verweisungen Festlegungen a

8、us anderen Publikationen.Diese normativen Verweisungen sind an den jeweiligen Stellen im Text zitiert, und die Publikationen sindnachstehend aufgefhrt. Bei datierten Verweisungen gehren sptere nderungen oder berarbeitungennur zu dieser Norm, falls sie durch nderung oder berarbeitung eingearbeitet si

9、nd. Bei undatierten Ver-weisungen gilt die letzte Ausgabe der in Bezug genommenen Publikation (einschlielich nderungen).DIN EN ISO 707, Milch und Milchprodukte Leitfaden zur Probenahme (ISO 707:1997); Deutsche Fas-sung EN ISO 707:1997.E DIN EN ISO 8968-1, Milch Bestimmung des Stickstoffgehaltes Teil

10、 1: Kjeldahl-Verfahren(ISO/DIS 8968-1:1998); Deutsche Fassung prEN ISO 8968-1:1998.3 BegriffeFr die Anwendung dieser Norm gelten die folgenden Begriffe:3.1Molkenproteinanteil im Gesamtproteinder mit dem in dieser Norm festgelegten Verfahren bestimmte Massenanteil an SubstanzenANMERKUNG Der Molkenpro

11、teinanteil im Gesamtprotein wird in Prozent angegeben.3.2Cystinwertdas Verhltnis der Masse an Cystin zu der Masse an StickstoffANMERKUNG Der Cystinwert wird in Mikrogramm Cystin je Milligramm Stickstoff (g/mg) angegeben.4 KurzbeschreibungVon der Probe wird der so genannte Cystinwert bestimmt. Dieser

12、 Wert ist ein Ma fr den Cystein- und denCystingehalt der Proteine einer Probe. Die Molkenproteine, die in Milch etwa 20 %1)des Gesamtproteinsdarstellen, enthalten viel Cystin und Cystein (Cystinwert etwa 235 g/mg N). Der Caseinanteil im Gesamt-protein von Milch betrgt etwa 80 %1). Die Caseine enthal

13、ten nur wenig Cystin und Cystein (Cystinwert et-wa 19 g/mg N).1) Massenanteil.Seite 3DIN 10466:2001-09Der Cystinwert eines Milchproduktes ist daher um so grer, je hher der Molkenproteinanteil am Gesamt-protein ist. Zur Bestimmung des Cystinwertes wird die Probe mit sulfithaltiger Harnstoff-Pufferlsu

14、ng ver-setzt. Dadurch wird Cystin zu Cystein reduziert.33SOSRSHRHSORSSR + (1)Anschlieend wird das Cystein mit Methylquecksilberchlorid umgesetzt.HClCHSHgRHgClCHSHR33+ (2)Das fr diese Umsetzung nicht verbrauchte Methylquecksilberchlorid wird polarographisch bestimmt.Der Polarograph wird mit einer Cys

15、tinlsung kalibriert und der Cystinwert als g Cystin je mg Stickstoff be-rechnet.Der Molkenproteinanteil im Gesamtprotein wird aus dem Cystinwert einer Probe und den Referenzwertenfr molkenproteinfreies Casein und fr caseinfreie Molkenproteine berechnet.5 Chemikalien5.1 AllgemeinesEs sind analysenrei

16、ne Chemikalien zu verwenden. Das verwendete Wasser muss destilliert oder min-destens von entsprechender Reinheit sein.5.2 Sulfithaltige Harnstoff-Pufferlsung pH = 9,39 g Ammoniumchlorid, NH4Cl40 g Kaliumchlorid, KCl25 g Natriumsulfit (wasserfrei), Na2SO3500 g Harnstoff, CH4N2O1 g Triton X-100Ge22)we

17、rden zusammen in Wasser gelst, mit Ammoniaklsung w(NH3) = 25 %3)auf einen pH-Wert von 9,3 ein-gestellt und mit Wasser zu 1 l aufgefllt. Die Pufferlsung ist verschlossen aufbewahrt, bei Raumtempera-tur vier bis acht Wochen verwendbar.5.3 Methylquecksilberchlorid-LsungenWARNUNG Methylquecksilberchlori

18、d (CH3HgCl) ist hochgiftig und ist wie alle Quecksilberverbin-dungen zu entsorgen (MAK-Wert: 0,01 mg/m3). Folgende Punkte sind bei der Handhabung zu beach-ten: Nicht direkt einatmen! Beim Einwgen Wgeglschen mit Deckel verwenden! Vernderungender Substanzmenge nur unter dem Abzug vornehmen! Hautkontak

19、t vermeiden! Beim Herstellen derLsungen Einmalhandschuhe tragen! Zum Pipettieren stets Sicherheitspipetten (z. B. Kolben-pipette) benutzen.2) Triton X-100ist ein Beispiel fr ein geeignetes handelsbliches Produkt. Diese Angabe dient nur zur Unterrich-tung der Anwender dieser Norm und bedeutet keine A

20、nerkennung dieses genannten Produktes durch das DIN.Gleichwertige Produkte drfen verwendet werden, wenn sie nachweisbar zu identischen Ergebnissen fhren.3) w ist der Massenanteil.Seite 4DIN 10466:2001-095.3.1 Stammlsung(625 10) mg Methylquecksilberchlorid (CH3HgCl) werden auf einer oberschaligen Waa

21、ge im Abzug (!) inein Wgeglschen mit Deckel eingewogen, mit etwas N,N-Dimethylformamid gelst und quantitativ mitN,N-Dimethylformamid in einen 25-ml-Messkolben bergefhrt. Es wird mit N,N-Dimethylformamid bis zurMarke aufgefllt. Die Lsung ist bei Raumtemperatur haltbar.5.3.2 Messlsung2 ml der Stammlsu

22、ng werden in einen 100-ml-Messkolben mit 23 ml N,N-Dimethylformamid (Messzylinderoder Dosimat) verdnnt und mit destilliertem Wasser auf 100 ml aufgefllt.Fr jede CH3HgCl-Stammlsung (5.3.1) muss mit der Messlsung eine Kalibriergerade erstellt werden.5.4 Cystin-StandardlsungEtwa 110 mg Cystin werden in

23、 ein 50-ml-Becherglas auf 0,1 mg eingewogen und in 20 ml Salzsure,c (HCl) = 1 mol/l, gelst. Die Lsung wird mit Wasser in einen 1 000-ml-Messkolben quantitativ berge-splt. Anschlieend wird der Messkolben mit destilliertem Wasser aufgefllt und gemischt. Diese Lsung iststets frisch herzustellen.5.5 Sal

24、zsure-Lsungen5.5.1 c (HCl) = 1 mol/l4)5.5.2 c (HCl) = 0,02 mol/l4)5.6 Stickstoff hoher Reinheit, Volumenkonzentration = 99,999 %5.7 Petroleumbenzin, Siedebereich von 40 C bis 60 C (siehe 8.1).6 Gerte und Hilfsmittel6.1 AllgemeinesEs sind die Gerte und Hilfsmittel nach E DIN EN ISO 8968-1 sowie die i

25、n 6.2 bis 6.12 aufgefhrten zuverwenden.6.2 Waagen6.2.1 Oberschalige Waagen, Skalenteilungswert 0,001 g6.2.2 Analysenwaage, Skalenteilungswert 0,1 mg6.3 Polarograph mit Polarographierstand, geeignet zur differentiellen Pulspolarographie. Vorzugs-weise ausgestattet mit einer temperierbaren Messzelle.

26、Das verwendete Quecksilber muss Analysen-qualitt besitzen.4) c ist die Stoffmengenkonzentration.Seite 5DIN 10466:2001-09Beispiel fr eine GerteeinstellungUStart 0,2 VU 1,5 Vtdrop0,8 smm/tdrop0,25UDP250 0,2 mV6.4 Thermostat, einstellbar auf (20 1) C6.5 1-mlll -, 2-mlll -, 3-mlll -, 4-mlll -, 5-mlll -

27、und 25-mlll -Vollpipetten, z. B. nach DIN 126916.6 5-mlll -Messpipette, z. B. nach DIN 126976.7 2-mlll -Kolbenhubpipette, z. B. nach DIN 12650-26.8 25-mlll -Messzylinder oder Dosimat6.9 Messkolben, Nennvolumen 25 ml, 100 ml und 1 000 ml, z. B. nach DIN EN ISO 10426.10 Becherglser, Nennvolumen 100 ml

28、, z. B. nach DIN 123316.11 Glasstbe, Lnge etwa 12 cm, Durchmesser etwa 0,5 cmWahlweise bei stark fetthaltigen Proben zustzlich die Gerte nach 6.12 und 6.13.6.12 Soxhlet-Apparatur mit Extraktionshlsen6.13 Gefriertrocknungsanlage oder Vakuumtrockenschrank, einstellbar auf (50 2) C7 ProbenahmeNach DIN

29、EN ISO 7078 Durchfhrung8.1 Vorbereitung stark fetthaltiger ProbenStark fetthaltige Proben wie Sahne, Kondensmilch, Frischkse und Kse mit mehr als 40 % Massenanteilan Fett in der Trockenmasse mssen weitgehend entfettet werden. Hierzu werden die Proben mit einemgeeigneten Gert nach 6.13 getrocknet und

30、 die Pulver anschlieend in einer Soxhlet-Apparatur nach 6.12etwa 2,5 h mit Petroleumbenzin (5.7) extrahiert.8.2 EinwaageVon jeder Probe werden vier bis fnf unterschiedliche Mengen, die innerhalb der in Tabelle 1 angegebenenBereiche liegen, in 100-ml-Becherglser (6.10) eingewogen.Seite 6DIN 10466:200

31、1-09Tabelle 1 Richtwerte fr Einwaagen einiger MilchprodukteProduktEinwaagemgMilch, Buttermilch, Molke 400 bis 1 600Milchpulver, Buttermilchpulver, Caseine, Caseinate, Molkenpulver, Kse, Speise-eis nach Probenvorbereitung nach 8.140 bis 160Speisequark (alle Fettgehaltsstufen) 200 bis 600Molkenprotein

32、pulver 7 bis 308.3 Bestimmung8.3.1 Stickstoff- bzw. ProteinbestimmungBei Milch und Milchprodukten ohne besonderen Proteinabbau (Milchpulver, Molke, Molkenpulver, Butter-milch, Buttermilchpulver, Retentat, Permeat, Joghurt, Speiseeis) ist der Stickstoffgehalt der mit Zinksulfatund Natronlauge fllbare

33、n Stickstoffverbindungen zu bestimmen. Bei Caseinen, Caseinaten,reinen Milcheiweipulvern sowie bei Frischksen und gereiften Ksen ist der Gesamtstickstoffgehalt nachE DIN EN ISO 8968-1 zu bestimmen.8.3.2 LeerwertEs werden 5 ml Salzsure-Lsung (5.5), c = 0,02 mol/l, 25 ml sulfithaltige Harnstoff-Puffer

34、lsung (5.2) und2 ml Messlsung nach 5.3.2 in ein Polarographiergef pipettiert und auf (20 1) C vortemperiert. Dannwird kurz (etwa 1 min) Stickstoff erst durch die Lsung und danach ber diese hinweggeleitet. Nachdem dieLsung wieder zur Ruhe gekommen ist (nach etwa 1 min), wird das Polarogramm bei (20 1

35、) C aufge-zeichnet. Bei herkmmlichen Polarographen wird die Peakhhe beim Halbstufenpotential der Methylqueck-silberchlorid-Lsung (um 570 mV) ermittelt. Als Peakhhe H0gilt der senkrechte Abstand in Millimetervon der Spitze des Peaks zur Tangente, die am tiefsten Punkt des rechten Kurvenastes angelegt

36、 wird. BeiVA-Prozessoren wird mit dem nA-Wert beim Halbstufenpotential gerechnet.8.3.3 ProbenwertDie Pulvereinwaagen in den 100-ml-Becherglsern werden mit 5 ml Salzsure-Lsung, c = 0,02 mol/l, und25 ml sulfithaltiger Harnstoff-Pufferlsung versetzt und mit einem Glasstab umgerhrt bis sich die Probewei

37、tgehend gelst hat. Bei Milch, flssigen Milchprodukten und Speisequark wird die Einwaage mit Salz-sure-Lsung, c = 0,02 mol/l, auf 5 g (Messpipette) ergnzt und mit 25 ml sulfithaltiger Harnstoff-Pufferlsung versetzt.Dann werden 2,0 ml Methylquecksilberchlorid-Lsung nach 5.3.2 zugesetzt, und es wird er

38、neut umgerhrt.Mit einer Folie abgeschlossen, knnen so 15 bis 20 Einwaagen fr die Polarographie vorbereitet werden.Der jeweils zur Polarographie anstehende Ansatz wird in einem Wasserbad auf 20 C vortemperiert unddann in das (temperierbare) Polarographiergef bergefhrt. Es wird kurz (etwa 1 min) Stick

39、stoff durchdie Lsung geleitet, anschlieend 1 min, bei fetthaltigen Proben 4 min gewartet (der Stickstoff strmt dabeiber den Ansatz hinweg) und dann das Polarogramm bei (20 1) C erstellt. Die Peakhhe (H1bis H5)bzw. der nA-Wert wird wie beim Leerwert beschrieben ermittelt.8.3.4 KalibrierungVon der Cys

40、tin-Standardlsung werden x ml (x = 1 bis 5) im Polarographiergef oder 100-ml-Becherglasmit (5 minus x ml) Salzsure-Lsung (c = 0,02 mol/l), 25 ml Pufferlsung nach 5.2 und 2,0 ml Methylqueck-silberchlorid-Lsung nach 5.3.2 versetzt und bei (20 1) C in einem (temperierbaren) Polarographiergefpolarograph

41、iert. Die Peakhhen H1Cbis H5Csind wie in 8.3.2 beschrieben zu ermitteln. Die Peakerniedri-gungen y (in mm bzw. nA) werden gegen die je Ansatz enthaltene Masse Cystin x (in mg) aufgetragen. Ausden x- und den dazugehrigen y-Werten ist die Regressionsgerade zu berechnen. Die Steigung b der Ge-raden ent

42、spricht der Peakerniedrigung je mg Cystin.Seite 7DIN 10466:2001-09Die Kalibrierung ist zu wiederholen, wenn eine neue CH3HgCl-Stammlsung zum Einsatz kommt oderwenn trotz gleicher Stammlsung fr den Leerwert mit einer frisch bereiteten CH3HgCl-Messlsung einestetige Abnahme beobachtet wird, denn dies d

43、eutet auf eine langsame Vernderung der Kapillareigen-schaften hin. Die Kapillare sollte dann erneuert werden.Zur Aufstellung der Geradengleichung und damit zur Bestimmung der Steigung bcwren theoretisch zweiMesspunkte ausreichend. Um den Fehler mglichst gering zu halten, werden fnf Geradenpunkte erm

44、ittelt.Liegt bei der Aufzeichnung der Geraden ein Wert deutlich daneben, wird dieser abweichende Wert elimi-niert. Der Korrelationskoeffizient r sollte grer als 0,999 7 sein.9 Auswertung9.1 Berechnung9.1.1 Berechnung der Peakerniedrigung je Milligramm (mit ZnSO4und Natronlauge fllbarem)Stickstoff de

45、r ProbeFr jede Einwaage wird die Masse an Stickstoff bzw. die Masse an mit ZnSO4und NaOH fllbarem Stick-stoff berechnet (x-Werte) und die Peakerniedrigung des Leerwertes durch die Probe festgestellt (y-Werte:H0 H1, H0 H2usw.). Aus den so erhaltenen x-Werten und den dazugehrigen y-Werten ist die Glei

46、-chung der Geraden y = bx + a zu ermitteln. Die Steigung b der Geraden entspricht der Peak-erniedrigungbezogen auf die Masse an (mit ZnSO4und Natronlauge fllbarem) Stickstoff in Millimeter je Milligrammmm/mg (bzw. Nanoampere je Milligramm nA/mg).9.1.2 Berechnung des Cystinwertes der ProbeDer Cystinw

47、ert der Probe, C,N, angegeben als Massenverhltnis in Mikrogramm Cystin je Milligramm Stick-stoff, wird nach Gleichung (3) berechnet:CNyyC,N=310 (3)Dabei istyNdie Peakerniedrigung bezogen auf die Masse an Stickstoff, angegeben in Millimeter bzw. Nano-ampere je Milligramm Stickstoff;yCdie Peakerniedri

48、gung bezogen auf die Masse an Cystin, angegeben in Millimeter bzw. Nano-ampere je Milligramm Cystin.9.1.3 Berechnung des Molkenproteinanteils im Gesamtprotein der ProbeDer Molkenproteinanteil wMPim Gesamtprotein, angegeben als Massenanteil in Prozent, wird nachGleichung (4) berechnet:10019235)19(,=N

49、CwMP(4)Dabei ist C,Nder Cystinwert der Probe nach 9.1.2.Seite 8DIN 10466:2001-099.2 Przision9.2.1 AllgemeinesDie Przisionsdaten wurden in einem nach DIN ISO 57255)durchgefhrten Ringversuch an lyophilisiertemSpeisequark mit einem Molkenproteinanteil von 6 % (a) bzw. 18 % (b) ermittelt.9.2.2 WiederholprzisionDie Differenz zwischen zwei

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