1、August 2010DEUTSCHE NORM Normenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL) im DINPreisgruppe 9DIN Deutsches Institut fr Normung e.V. Jede Art der Vervielfltigung, auch auszugsweise, nur mit Genehmigung des DIN Deutsches Institut fr Normung e.V., Berlin, gestattet.ICS 67.180.10!$bXJ
2、“1635339www.din.deDDIN 10741Untersuchung von Honig Allgemeine Leitlinien fr die ad hoc-Validierung von Analysenmethodenfr organische Rckstnde oder KontaminantenAnalysis of honey General guidelines for the ad hoc validation of analysis methods for organic residues orcontaminantsAnalyse du miel Guide
3、gnral pour la validation ad hoc des mthodes danalyse des rsidus organiquesou contaminantsAlleinverkauf der Normen durch Beuth Verlag GmbH, 10772 Berlin www.beuth.deGesamtumfang 13 SeitenDIN 10741:2010-08 Inhalt Seite Vorwort . 3 Einleitung 4 1 Anwendungsbereich 5 2 Begriffe 5 3 Abkrzungen. 7 4 Valid
4、ierungsverfahren 7 4.1 Allgemeines. 7 4.2 Leistungsmerkmale fr die ad hoc-Validierung 8 4.3 Leitlinien fr die ad hoc-Validierung. 11 Literaturhinweise . 13 2 DIN 10741:2010-08 Vorwort Dieses Dokument wurde vom Normenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL) im DIN, Arbeitsausschu
5、ss NA 057-05-08 AA Honiguntersuchung“, erarbeitet. 3 DIN 10741:2010-08 Einleitung Die Validierung einer Methode stellt die unbedingte Voraussetzung fr die hinreichende Genauigkeit eines Analysenergebnisses dar. In dieser Norm werden die einzelnen Schritte fr die Durchfhrung der ad hoc-Validierung vo
6、n Analysen-methoden fr organische Rckstnde oder Kontaminanten in Honig beschrieben. Die Norm legt allgemeine Leitlinien fr die Vorgehensweise bei der Validierung von nicht validierten Analysenmethoden, die eine rasche Erstellung von Analysenergebnissen erfordern, fest. In dieser Norm werden weiterhi
7、n Leistungskriterien fr diese Validierung beschrieben. Die fr amtliche Untersuchungen geltenden Rechtsgrundlagen fr Validierungen werden von den Festlegungen dieser Norm nicht betroffen. Sie gelten unverndert weiter. 4 DIN 10741:2010-08 1 Anwendungsbereich Diese Norm legt Verfahrensgrundstze fr eine
8、 laborinterne ad hoc-Validierung bei der Untersuchung von Honig auf organische Rckstnde oder Kontaminanten fest. Die fr amtliche Untersuchungen geltenden Rechtsgrundlagen fr Validierungen werden von dieser Norm nicht betroffen und gelten unverndert weiter. 2 Begriffe Fr die Anwendung dieses Dokument
9、s gelten die folgenden Begriffe. 2.1 ad hoc-Validierung Validierung mit reduzierten Anforderungen 2.2 Leistungsmerkmal funktionelle Qualitt, die einer Analysenmethode zugeschrieben werden kann BEISPIEL Leistungsmerkmale knnen die Spezifitt, Genauigkeit, Richtigkeit, Wiederholprzision, Reproduzier-ba
10、rkeit, Wiederfindung, das Nachweisvermgen oder die Robustheit sein. 2.3 Leistungskriterien Anforderungen an ein Leistungsmerkmal, nach denen beurteilt werden kann, ob die Analysenmethode fr den Zweck geeignet ist und zuverlssige Ergebnisse liefert 2.4 Genauigkeit Ausma der Annherung zwischen einem E
11、rmittlungsergebnis und dem anerkannten Bezugswert ANMERKUNG Wird der Ausdruck “Genauigkeit“ auf eine Serie von Ermittlungsergebnissen angewendet, umfasst er eine Kombination von Zufallskomponenten sowie eine gemeinsame systematische Abweichung oder eine gemeinsame Abweichungskomponente. DIN ISO 5725
12、-1:1997, Begriff 3.6 2.5 Richtigkeit Ausma der Annherung zwischen dem Mittelwert aus einer groen Serie von Ermittlungsergebnissen und einem anerkannten Bezugswert ANMERKUNG 1 Das Richtigkeitsma wird blicherweise ausgedrckt mittels einer systematischen Abweichungs-komponente. ANMERKUNG 2 Richtigkeit
13、wurde frher als Genauigkeit des Mittelwerts“ bezeichnet. Diese Benennung wird nicht empfohlen. DIN ISO 5725-1:1997, Begriff 3.7 5 DIN 10741:2010-08 2.6 Przision Ausma der gegenseitigen Annherung zwischen unabhngigen Ermittlungsergebnissen, die unter festge-legten Bedingungen gewonnen sind ANMERKUNG
14、1 Przision hngt ausschlielich von der Verteilung zuflliger Abweichungen ab und bezieht sich nicht auf den wahren oder vorgegebenen Wert. ANMERKUNG 2 Das Przisionsma wird blicherweise damit ausgedrckt, wie unprzise etwas ist“. Errechnet wird es als Standardabweichung der Ermittlungsergebnisse. Gering
15、ere Przision spiegelt sich in einer greren Standardabweichung wider. ANMERKUNG 3 Unabhngige Ermittlungsergebnisse“ bedeutet Ergebnisse, die unbeeinflusst durch irgendein vorausgehendes Ergebnis am selben oder an einem hnlichen Untersuchungsobjekt gewonnen werden. Quantitative Przisionsmae hngen ents
16、cheidend von den festgelegten Bedingungen ab. Wiederholbedingungen und Vergleichbedingungen sind ein besonderes Paar von extremen Bedingungen. DIN ISO 5725-1:1997, Begriff 3.12 2.7 Spezifitt Fhigkeit, den nachzuweisenden Analysenstoff zu erkennen, wobei er von anderen Stoffen, Verunreini-gungen, Abb
17、auprodukten unterschieden wird 2.8 Selektivitt Fhigkeit einer Methode, verschiedene, nebeneinander zu bestimmende Komponenten ohne gegenseitige Strung zu erfassen und zu bestimmen 2.9 Identifikation Anlegung der Untersuchungsmethode in der Form, dass der zu untersuchende Stoff qualitativ hinreichend
18、 eindeutig bestimmbar ist 2.10 Nachweisgrenze derjenige Gehalt, der unter Verwendung der ermittelten Kalibrierfunktion dem kritischen Wert der Messgre zuzuordnen ist 2.11 Bestimmungsgrenze Gehalt, bei dem unter Zugrundelegung einer festgelegten Wahrscheinlichkeit, , die relative Ergebnisun-sicherhei
19、t, definiert als Quotient aus dem halben zweiseitigen Prognoseintervall und dem zugehrigen Gehalt, einen vorgegebenen Wert annimmt 2.12 Linearitt Zusammenhang, bei dem sich die mit dem Verfahren ermittelten Ergebnisse proportional zur Konzentration des Analyten verhalten 2.13 Berichtsgrenze niedrigs
20、te Konzentration des Analyten, die im Ergebnisbericht aufgefhrt wird 2.14 Entscheidungsgrenze Konzentration, ber der mit einer statistischen Wahrscheinlichkeit von 1 festgestellt werden kann, dass der zulssige Grenzwert tatschlich berschritten worden ist bzw. ob der betreffende Analyt vorhanden ist
21、6 DIN 10741:2010-08 3 Abkrzungen Cl Chemische Ionisierung CI-GC-MS Gaschromatografie mit gekoppelter Massenspektrometrie und chemischer Ionisierung DAD Diodenarray Spektralfotometer El Ionenstoionisierung EI-GC-MS Gaschromatografie mit gekoppelter Massenspektrometrie und Ionenstoionisierung GC Gasch
22、romatografie GC-MS Gaschromatografie mit gekoppelter Massenspektrometrie GC-MSn Gaschromatografie mit gekoppelter multipler Massenspektrometrie HPLC Hochleistungsflssigchromatografie HRMS hochauflsende Massenspektrometrie LC Flssigchromatografie LC-MS Flssigchromatografie mit gekoppelter Massenspekt
23、rometrie LC-MSn Flssigchromatografie mit gekoppelter multipler Massenspektrometrie LR-MS niedrigauflsende Massenspektrometrie LR-MSn niedrigauflsende multiple Massenspektrometrie MS Massenspektrometrie SIM Einzelmassenregistrierung SRM Registrierung von Massenbergngen TLC Dnnschichtchromatografie 4
24、Validierungsverfahren 4.1 Allgemeines Bei einer Validierung werden Leistungsmerkmale zugrunde gelegt. BEISPIEL Siehe Kriterien in der Verordnung VO (EG) 882/2004, Anhang III 1. Eine ad hoc-Validierung erfordert in der Regel verringerte Anforderungen. Sie muss jedoch eine hinreichende Genauigkeit des
25、 Analysenergebnisses an der angestrebten Entscheidungsgrenze sicherstellen. Wenn Analysenergebnisse sehr rasch mit einer nicht validierten Untersuchungsmethode erzielt werden mssen, sind mindestens die in dieser Norm genannten Anforderungen zu erfllen. 7 DIN 10741:2010-08 4.2 Leistungsmerkmale fr di
26、e ad hoc-Validierung 4.2.1 Allgemeines Liegt im Labor kein validiertes Verfahren vor und sind Proben unverzglich zu analysieren, sollten vor der Angabe eines Ergebnisses im Rahmen einer ad hoc-Validierung mindestens die nachfolgenden Leistungs-merkmale ermittelt und dokumentiert werden. 4.2.2 Richti
27、gkeit Die Wiederfindungsrate sollte im Bereich von 50 % bis 120 % sein. 4.2.3 Przision Die Przision wird als Variationskoeffizient VKausgedrckt. VKsollte 25 % sein. 4.2.4 Identifikation 4.2.4.1 Allgemeines Die Identifikation sollte durch die nachfolgend genannten Verfahren erfolgen. 4.2.4.2 Chromato
28、graphische Trennung Die chromatographische Trennung muss mit geeigneten Sulen durchgefhrt werden. In jedem Fall betrgt die akzeptable Mindestretentionszeit fr den untersuchten Analyten das Doppelte der Retentionszeit fr das Totvolumen der Sule. Die Retentionszeit bzw. relative Retentionszeit des Ana
29、lyten in der Analysenprobe muss derjenigen des Kalibrierstandards innerhalb eines vorgegebenen Retentionszeitfensters entsprechen. Das Retentionszeitfenster muss dem Auflsungsvermgen des Chromatografiesystems entsprechen. Das Verhltnis der chromatografischen Retentionszeit des Analyten zu der des in
30、ternen Standards, d. h. die relative Retentionszeit des Analyten, muss derjenigen der Kalibrierlsung entsprechen, bei Grenzab-weichungen von hchstens 0,5 % fr die GC und 2,5 % fr die LC. 4.2.4.3 Aufnahme von UV- bzw. VIS-Spektren Als Akzeptanzkriterium gilt, dass die Absorptionsmaxima im Spektrum de
31、s Analyten mit Grenzabweichungen von hchstens 2 nm bei denselben Wellenlngen wie die des Kalibrierstandards liegen mssen. Das Analyt-spektrum oberhalb von 220 nm darf sich im Bereich mit einem relativen Absorptionsvermgen von 10 % optisch nicht vom Spektrum des Kalibrierstandards unterscheiden. Dies
32、es Kriterium ist erfllt, wenn zum einen die gleichen Maxima vorliegen und zum anderen der Unterschied zwischen den beiden Spektren an keinem Punkt mehr als 10 % des Absorptionsvermgens des Kalibrierstandards betrgt. 4.2.4.4 Massenspektrometrischer Nachweis 4.2.4.4.1 Allgemeines Der massenspektrometr
33、ische Nachweis muss mit MS-Verfahren wie beispielsweise der Aufzeichnung von vollen Massenspektren (Full Scan) oder der Einzelmassenregistrierung (SIM) sowie MS-MSn-Verfahren wie dem Selected Reaction Monitoring (SRM) oder anderen geeigneten MS- oder MS-MSn-Verfahren in Kombination mit entsprechende
34、n Ionisierungsarten durchgefhrt werden. Bei der hochauflsenden Massenspektrometrie (HRMS) muss die Auflsung fr den gesamten Massenbe-reich bei 10 % Tal typischerweise grer als 10 000 sein. 8 DIN 10741:2010-08 4.2.4.4.2 Aufzeichnung von vollen Massenspektren (Full Scan) Wenn die massenspektrometrisch
35、e Bestimmung durch die Aufzeichnung von vollstndigen Spektren erfolgt, ist das Vorhandensein aller gemessenen diagnostischen Ionen (Molekl-Ion, charakteristische Addukte des Molekl-Ions, charakteristische Fragment-Ionen und Isotopen-Ionen) mit einer relativen Intensitt von mehr als 10 % im Referenzs
36、pektrum des Kalibrierstandards obligatorisch. 4.2.4.4.3 Einzelmassenregistrierung (SIM) Erfolgt die massenspektrometrische Bestimmung mittels Fragmentografie, muss das Molekl-Ion vorzugsweise eines der ausgewhlten diagnostischen Ionen sein (Molekl-Ion, charakteristische Addukte des Molekl-Ions, char
37、akteristische Fragment-Ionen und alle ihre Isotopen-Ionen). Die gewhlten diagnostischen Ionen sollten nicht ausschlielich aus demselben Teil des Molekls stammen. Das Signal-Rausch-Verhltnis fr jedes diagnostische Ion muss 3:1 sein. 4.2.4.4.4 Aufzeichnung von vollen Massenspektren (Full Scan) und Ein
38、zelmassenregistrierung (SIM) Die relativen Intensitten der nachgewiesenen Ionen, ausgedrckt in Prozent der Intensitt des intensivsten Ions oder bergangs, mssen denjenigen des Kalibrierstandards entsprechen, und zwar entweder aus Kalibrierstandardlsungen oder aus dotierten Proben in vergleichbaren Ko
39、nzentrationen, gemessen unter den gleichen Bedingungen innerhalb der in Tabelle 1 genannten Toleranzen. Tabelle 1 Zulssige Hchsttoleranzen fr relative Ionenintensitten bei einer Reihe von massenspektrometrischen Verfahren Relative Intensitt (% des Basispeaks) EI-GC-MS (relativ) CI-GC-MS, GC-MSn LC-M
40、S, LC-MSn(relativ) 50 % + 10 % + 20 % 20 % bis 50 % + 15 % + 25 % 10 % bis 20 % + 20 % + 30 % 4.2.4.4.5 Auswertung von Massenspektren 4.2.4.4.5.1 Allgemeines Die relativen Intensitten der diagnostischen Ionen und/oder Vorlufer-/Produkt-Ionenpaare mssen durch Vergleich von Spektren oder durch Integra
41、tion der Signale der Einzelmassen ermittelt werden. 4.2.4.4.5.2 volle Massenspektren (Full Scan) Wenn vollstndige Spektren in einer Einzelmassenspektrometrie aufgezeichnet werden, mssen mindestens vier Ionen mit einer relativen Intensitt von 10 % des Basispeaks vorhanden sein. Das Molekl-Ion sollte
42、eingeschlossen sein, wenn es im Referenzspektrum mit einer relativen Intensitt von 10 % vorhanden ist. Mindestens vier Ionen mssen innerhalb der zulssigen Hchsttoleranzen fr relative Ionenintensitten liegen, siehe Tabelle 1. Eine computergesttzte Bibliothekssuche kann durchgefhrt werden. In diesem F
43、all muss das Ergebnis des Vergleichs der Massenspektren der Untersuchungsproben mit dem der Kalibrierlsung einen kritischen Abgleichsfaktor berschreiten. Dieser Faktor wird bei der Validierung fr jeden Analyten auf der Basis von Spektren bestimmt, fr welche die hier beschriebenen Kriterien erfllt si
44、nd. Schwankungen in den Spektren, die durch die Probenmatrix und die Leistungsfhigkeit des Detektors verursacht werden knnen, mssen berprft werden. 9 DIN 10741:2010-08 4.2.4.4.5.3 Einzelmassenregistrierung (SIM) Wenn Massenfragmente nicht mit Full-Scan-Verfahren gemessen werden, muss ein System von
45、Identifizierungspunkten zur Auswertung der Daten verwendet werden. Zur Besttigung von Stoffen in Gruppe A des Anhangs 1 der Richtlinie 96/23/EG 2 werden mindestens vier Identifizierungspunkte bentigt. Zur Besttigung von Stoffen in Gruppe B von Anhang 1 der Richtlinie 96/23/EG 2 werden mindestens dre
46、i Identifizierungspunkte bentigt. Die Tabelle 2 zeigt die Anzahl der Identifizierungspunkte, die jedes der massenspektrometrischen Basisverfahren liefern kann. Die Tabelle 3 enthlt einige Berechnungsbeispiele zur Erreichung der bentigten Zahl der Identifizierungspunkte. Damit jedoch die fr die Bestt
47、igung erforderlichen Identifizierungspunkte vergeben und die Summe der Identifizierungspunkte berechnet werden knnen, mssen folgende drei Voraussetzungen erfllt sein: a) mindestens ein Ionenverhltnis muss gemessen werden; b) alle relevanten gemessenen Ionenverhltnisse mssen die in Tabelle 1 beschrie
48、benen Kriterien erfllen; c) maximal drei separate Verfahren knnen kombiniert werden, um die Mindestanzahl an Identifizierungs-punkten zu erhalten. Tabelle 2 Zusammenhang zwischen einer Reihe von Massenfragment-Klassen und erzielten Identifizierungpunkten MS-Verfahren Erzielte Identifizierungspunkte
49、pro Ion Niedrig auflsende Massenspektrometrie (LR-MS) 1,0 LR-MSnVorlufer-Ion 1,0 LR-MSnbergangsprodukte 1,5 HRMS 2,0 HR-MSnVorlufer-Ion 2,0 HR-MSnbergangsprodukte 2,5 Jedes Ion kann nur einmal gezhlt werden. Die GC-MS mit Elektronenstoionisierung gilt als ein anderes Verfahren als die GC-MS mit chemischer Ionisierung. Um die bentigte Anzahl der
