1、Februar 2009DEUTSCHE NORM Normenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL) im DINPreisgruppe 6DIN Deutsches Institut fr Normung e.V. Jede Art der Vervielfltigung, auch auszugsweise, nur mit Genehmigung des DIN Deutsches Institut fr Normung e.V., Berlin, gestattet.ICS 67.180.10!$TU
2、(“1495005www.din.deDDIN 10750Untersuchung von Honig Bestimmung der Diastase-AktivittAnalysis of honey Determination of diastase activityAnalyse du miel Dtermination de lactivit de diastaseAlleinverkauf der Normen durch Beuth Verlag GmbH, 10772 BerlinErsatz frDIN 10750:2006-07www.beuth.deGesamtumfang
3、 8 SeitenDIN 10750:2009-02 2 Vorwort Diese Norm wurde vom Normenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL), Arbeitsaus-schuss NA 057-05-08 AA Honiguntersuchung“, erarbeitet. nderungen Gegenber DIN 10750:1995-04 wurden folgende nderungen vorgenommen: a) der Unterabschnitt 7.3 zur K
4、alibrierung der Reaktionsmischung wurde inhaltlich gendert. Die notwendige Wassermenge zum Erreichen der Extinktion im Bereich von 0,745 bis 0,777 kann zwischen 10 ml und 25 ml liegen; b) die Norm wurde redaktionell berarbeitet. Gegenber DIN 10750:2006-07 wurde folgende Korrekturen vorgenommen: a) i
5、m Abschnitt 8.3.3 Vergleichgrenze R“ wurde in der Gleichung zur Berechnung von R vor dem Wert 0,237“ anstelle eines Multiplikationszeichens ein Minuszeichen gesetzt. Frhere Ausgaben DIN 10750: 1990-07, 1995-04, 2006-07 1 Anwendungsbereich Diese Norm legt ein Verfahren zur Bestimmung der Diastase-Akt
6、ivitt (-Amylase-Aktivitt) in Honig fest. 2 Begriffe Fr die Anwendung dieses Dokuments gelten die folgenden Begriffe. 2.1 Diastase-Aktivitt die nach dem in dieser Norm beschriebenen Verfahren ermittelte Reaktionszeit, in der von einer definierten Menge Honig eine definierte Menge an Strke bis zu eine
7、m vorgegebenen Endpunkt abgebaut wird. Die Diastase-Aktivitt wird als Diastase-Zahl (DZ) angegeben. ANMERKUNG Die Diastase-Zahl entspricht unter den Bedingungen dieses Verfahrens der Enzymaktivitt in 1 g Honig, die eine definierte Strkemenge von 0,01 g von einem bestimmten Blauwert an in 1 h bei 40
8、C zu einem vorgegebenen Endpunkt abzubauen vermag. 3 Kurzbeschreibung Definierte Volumina an Strke- und Probenlsung werden getrennt in einem dafr geeigneten Reaktionsgef auf 40 C erwrmt und anschlieend grndlich vermischt. Danach werden in periodischen Zeitabstnden jeweils gleiche Volumina an Reaktio
9、nsmischung aus dem Reaktionsgef entnommen und nach Stoppen der Reaktion mit Iod-Lsung und entsprechender Verdnnung mit Wasser die optische Dichte der Iod-Strke-Lsung photometrisch gemessen. Aus der mit Hilfe der Zeit-Messwert-Paare festgelegten Reaktionskurve wird die Zeit abgelesen, die bis zum Err
10、eichen der vorgegebenen, dem Abbau von 1 g Strke entsprechenden optischen Dichte vergangen ist. DIN 10750:2009-02 3 4 Chemikalien Soweit nicht anders angegeben, sind analysenreine Chemikalien zu verwenden. Das Wasser muss entweder destilliert oder von entsprechender Reinheit sein. Unter Lsung ist ei
11、ne wssrige Lsung zu verstehen. 4.1 Natriumchlorid-Lsung, = 2,9 g/(100 ml)1)4.2 Natriumacetat-Pufferlsung, pH = 5,3 Es werden 43,5 g Natriumacetat (CH3COONa 3 H2O) in Wasser gelst, mit etwa 5 ml Essigsure (Eisessig) auf pH = 5,3 eingestellt und auf 250 ml aufgefllt. 4.3 Strke-Lsung 4.3.1 Bestimmung d
12、er Trockenmasse der Strke Fr die Strke-Lsung sind nur lsliche Strken zu verwenden, die bei dem unter 7.3 beschriebenen Kalibrie-rungsverfahren eine klare, rein blaue Lsung der festgelegten optischen Dichte liefern.2)Etwa 2 g der lufttrockenen lslichen Strke werden auf dem Boden eines vorgetrockneten
13、 und tarierten niedrigen Wgeglases mit Deckel (etwa 5 cm Durchmesser, 3 cm Hhe) gleichmig in dnner Schicht verteilt, auf 0,1 mg gewogen und 90 min bei 130 C getrocknet. Das mit dem Deckel verschlossene Wgeglas wird zum Abkhlen etwa 1 h in den Exsikkator gestellt und anschlieend auf 0,1 mg gewogen. 4
14、.3.2 Herstellung der Strke-Lsung Die einer Trockenmasse von 2,000 g entsprechende Menge Strke wird in einen 250-ml-Erlenmeyerkolben eingewogen, mit 90 ml Wasser versetzt und unter Schwenken gemischt. Die so erhaltene Suspension wird unter stndigem Schwenken des Kolbens schnell zum Sieden erhitzt und
15、 insgesamt 3 min am Sieden gehalten. Danach wird die heie Lsung sofort in einen 100-ml-Messkolben bergefhrt, unter flieendem Wasser rasch auf Raumtemperatur abgekhlt, mit Wasser zur Marke aufgefllt und grndlich gemischt. Die Lsung ist am Tage der Verwendung frisch herzustellen. 4.4 Iod-Stammlsung Es
16、 werden 11,0 g doppelt sublimiertes Iod und 22,0 g Kaliumiodid in 30 ml bis 40 ml Wasser gelst und auf 500 ml aufgefllt. Die Stammlsung ist bei Aufbewahrung in einer verschlossenen, dunklen Flasche etwa 1 Jahr haltbar. 4.5 Verdnnte Iod-Lsung Es werden 20,0 g Kaliumiodid in Wasser gelst und nach Zuga
17、be von 2 ml Stammlsung nach 4.4 auf 500 ml aufgefllt. Die verdnnte Iod-Lsung ist am Tage der Verwendung frisch herzustellen und vor bermigem Luftzutritt durch sofortiges Verschlieen des Vorratsbehltnisses nach Entnahme der bentigten Mengen zu schtzen. 1) = Massenkonzentration 2) ber Bezugsquellen gi
18、bt Auskunft: DIN-Bezugsquellen fr normgerechte Erzeugnisse im DIN Deutsches Institut fr Normung e.V., Burggrafenstrae 6, 10787 Berlin, Postanschrift 10772 Berlin. DIN 10750:2009-02 4 5 Gerte Die zur Durchfhrung der Bestimmung und zur Aufbewahrung von Reagenzien verwendeten Gerte mssen frei von Deter
19、gentien sein. 5.1 Sieb aus nichtrostendem Stahl, Maschenweite 0,50 mm 5.2 Reaktionsgef aus Glas (siehe Bild 1) 5.3 Wasserbad mit Thermostat, geeignet zur Einhaltung einer Temperatur von (40,0 0,2) C 5.4 Stoppuhr 5.5 Kvetten, Schichtdicke 1 cm 5.6 Spektralphotometer, oder Filterphotometer mit Schmalb
20、and-Interferenzfilter zur Messung bei 660 nm 5.7 Becherglas, z. B. Becher aus Glas nach DIN 12331 Mae in mm (Mae sind Ungefhrmae) Bild 1 Beispiele fr Reaktionsgefe zur Bestimmung der Diastase-Aktivitt 6 Probenahme Fr die Untersuchung ist eine Laboratoriumsprobe von mindestens 200 g zu verwenden. DIN
21、 10750:2009-02 5 7 Durchfhrung 7.1 Probenvorbereitung 7.1.1 Flssiger oder kandierter Honig ohne Verunreinigungen Die Laboratoriumsprobe ist durch intensives Rhren (mindestens 3 min) ausreichend zu homogenisieren. Dabei ist darauf zu achten, dass insbesondere bei Weiterverwendung der Probe zur Bestim
22、mung von Hydroxymethylfurfural (HMF) mglichst wenig Luft mit untergerhrt wird. 7.1.2 Flssiger oder kandierter Honig mit Verunreinigungen Nach Entfernung grober Verunreinigungen wird der Honig bei Raumtemperatur glatt gerhrt und durch ein Sieb nach 5.1 gegeben. Kandierter Honig wird mit einem Spatel
23、durch das Sieb nach 5.1 gerhrt. 7.1.3 Wabenhonig Falls die Waben noch geschlossen sind, werden sie zunchst entdeckelt. Mit Hilfe eines Siebes nach 5.1 wird der Honig ohne Erwrmung vollstndig von den Waben getrennt. 7.2 Herstellung der Probenlsung Es werden 10,0 g Honig in ein Becherglas eingewogen u
24、nd ohne Erwrmung in etwa 20 ml Wasser, dem 5 ml Natriumacetat-Pufferlsung zugegeben wurden, vollstndig gelst. Die Lsung wird danach quantitativ in einen 3 ml Natriumchlorid-Lsung ( = 2,9 g/(100 ml) enthaltenden 50-ml-Messkolben bergefhrt und mit Wasser zur Marke aufgefllt (Probenlsung). Es ist zu be
25、achten, dass die Zumischung von Natriumchlorid-Lsung erst nach Lsung des Honigs in Natriumacetat-Pufferlsung erfolgen darf, weil die Diastase-Aktivitt in Gegenwart von NaCl bei pH-Werten unter 4,0 sehr schnell abnimmt. ANMERKUNG Die Probenlsung ist nur wenige Stunden unverndert haltbar. Es empfiehlt
26、 sich daher, die Probenlsung immer unmittelbar vor Durchfhrung der Bestimmung anzusetzen. 7.3 Kalibrierung der Reaktionsmischung (Blauwert-Einstellung) Fr die Kalibrierung der Reaktionsmischung wird geprft, welche Wassermenge hinzugefgt werden muss, um die optische Dichte der Iod-Strke-Lsung auf ein
27、e Extinktion im Bereich von 0,745 bis 0,770 einzustellen. Je nach Hersteller und Charge knnen die Strken unterschiedlich sein. Die notwendige Wassermenge zum Erreichen der Extinktion im Bereich von 0,745 bis 0,770 kann zwischen 10 ml und 25 ml liegen. In acht geeignete Glasgefe (Reagenzglser) werden
28、 jeweils in einer aufsteigenden ganzzahligen arithmetischen Reihe Wasser (z. B. 12 ml, 13 ml, 14 ml, 15 ml, 16 ml, 17 ml, 18 ml, 19 ml) und je 5 ml verdnnte Iod-Lsung gegeben. Beginnend mit dem ersten Gef werden 0,5 ml eines Gemisches aus 10 ml Wasser und 5 ml Strke-Lsung hinzugegeben, gut durchgesc
29、httelt und sofort die Extinktion in einer 1-cm-Kvette bei 660 nm gegen Wasser gemessen. Nacheinander wird mit den anderen Gefen in gleicher Weise verfahren, bis eine optische Dichte von E = 0,770 bis E = 0,745 erhalten wird. Die so ermittelte Wassermenge ist die Standardverdnnung fr alle mit der Str
30、ke-Lsung durchgefhrten Bestimmungen. ANMERKUNG Die Zeit zwischen Zugabe der verdnnten Strke-Lsung und der Bestimmung der optischen Dichte sollte wegen der zeitlichen Abhngigkeit der Farbintensitt sowohl bei der Kalibrierung als auch der Bestimmung der Diastase-Aktivitt mglichst konstant sein. 7.4 Be
31、stimmung Es werden 10 ml der Probenlsung in den Hauptarm und 5 ml Strke-Lsung in den Seitenarm des Reak-tionsgefes pipettiert. Das Reaktionsgef wird so in das auf (40 0,2) C temperierte Wasserbad gestellt, dass eine gleichmige Erwrmung beider Lsungen sichergestellt, eine vorzeitige Vermischung jedoc
32、h ausgeschlossen ist. DIN 10750:2009-02 6 Nach 15 min Erwrmung wird das Reaktionsgef kurzzeitig aus dem Wasserbad entnommen und die im Seitenarm des Reaktionsgefes befindliche Strke-Lsung durch vier- bis fnfmaliges Kippen des Reak-tionsgefes und anschlieendes krftiges Schtteln mit der Probenlsung ge
33、mischt. Anschlieend wird das Reaktionsgef sofort wieder in das Wasserbad zurckgestellt. Mit Beginn des Mischvorganges wird gleich-zeitig die Stoppuhr in Gang gesetzt (Reaktionszeit t = 0). In periodischen Zeitabstnden (erstmals nach 5 min) werden jeweils 0,5 ml der Reaktionsmischung aus dem Reaktion
34、sgef entnommen und zwecks Stoppen der Reaktion schnell zu jeweils 5 ml verdnnter Iod-Lsung gegeben. Nach Zugabe der nach 7.3 ermittelten Wassermenge und anschlieender guter Durchmischung wird die Extinktion der jeweiligen Lsung (Probenmesslsung) in einer 1-cm-Kvette sofort bei 660 nm gegen Wasser ge
35、messen. Die Zeitabstnde nach der ersten Entnahme aus dem Reaktionsgef sind so zu bemessen, dass 3 bis 4 Messwerte im Bereich zwischen E = 0,456 und E = 0,155 erhalten werden. Als angenherte Richtwerte fr die Zeitabstnde zwischen den Entnahmen aus dem Reaktionsgef gelten die in Tabelle 1 gegebenen We
36、rte. Tabelle 1 Richtwerte fr die Zeitabstnde zwischen den Entnahmen aus dem Reaktionsgef E bei t = 5 min Zeitabstand E 0,658 10 min oder lnger 0,658 E 0,523 5 min bis 10 min 0,523 E 0,456 2 min bis 5 min Liegt die Extinktion bei t = 5 min unter etwa 0,350, ist es empfehlenswert, die Reaktionszeit fr
37、 die erstmalige Messung entsprechend zu reduzieren. 7.5 Blindwertkontrolle Es werden 10 ml der Probenlsung nach 7.2 mit 5 ml Wasser versetzt und grndlich durchgemischt. Anschlie-end werden 0,5 ml davon abpipettiert und zu 5 ml verdnnter Iod-Lsung gegeben. Nach Zugabe der nach 7.3 ermittelten Wasserm
38、enge und anschlieender Durchmischung wird die Extinktion in einer 1-cm-Kvette bei 660 nm gegen Wasser gemessen. Ergibt sich eine messbare Extinktion, so ist dieser Blindwert von den nach 7.4 ermittelten Messwerten abzuziehen. 8 Auswertung 8.1 Graphische Auswertung Die Extinktionswerte der Probenmess
39、lsungen werden gegebenenfalls nach Abzug der Blindwert-Extink-tion (siehe 7.5) auf Millimeterpapier gegen die entsprechenden Reaktionszeiten in Minuten aufgetragen. Fr die im Bereich E = 0,155 bis E = 0,456 liegenden Messpunkte wird die Ausgleichsgerade gezeichnet und mit Hilfe dieser der Zeitpunkt
40、txfr E = 0,301 ermittelt. Der Mastab fr die t- und E-Achse ist so zu whlen, dass die leichte Krmmung der Reaktionskurve im Bereich E = 0,155 bis E = 0,456 weitgehend kompensiert wird; eine ausreichend genaue Ablesung des Schnittpunktes der Ausgleichsgeraden mit der E = 0,301-Linie mglich ist. Anstel
41、le der graphischen Auswertung knnen die Ausgleichsgerade und der Zeitpunkt fr E = 0,301 durch Regressionsrechnung (lineare Regression) ermittelt werden, wobei ebenfalls nur Messpunkte im Bereich E = 0,155 bis E = 0,456 zu bercksichtigen sind. DIN 10750:2009-02 7 8.2 Berechnung Die Diastase-Aktivitt
42、wird als Diastase-Zahl (DZ) nach folgender Gleichung berechnet: DZ = xt300(1) Dabei ist txdie nach 8.1 ermittelte Reaktionszeit in Minuten (min). Das Ergebnis wird auf 0,1 gerundet angegeben. 8.3 Przision des Verfahrens 8.3.1 Allgemeines Die Werte fr die Wiederholgrenze und die Vergleichgrenze sind
43、aus Ringversuchen gewonnen worden. Sie gelten mit einer Wahrscheinlichkeit von 95 %. Das bedeutet, dass im Durchschnitt bei 20 Untersuchungen einmal eine berschreitung der angegebenen Werte erwartet werden kann. 8.3.2 Wiederholgrenze r Als Differenz der Ergebnisse zweier Bestimmungen, die nach demse
44、lben Verfahren mit identischem Untersu-chungsmaterial unter denselben Bedingungen (derselbe Untersucher, dieselben Gerte, dasselbe Laborato-rium) unmittelbar nacheinander durchgefhrt werden, ist hchstens der nach Gleichung (2) berechnete Wert zu erwarten. r = 1,424 4 105 DZ2+ 0,024 1 DZ + 0,179 99 (
45、2) sr= 5,033 2 106 DZ2+ 8,515 9 103 DZ + 0,063 6 (3) 8.3.3 Vergleichgrenze R Als Differenz der Ergebnisse zweier voneinander unabhngiger Bestimmungen, die nach demselben Ver-fahren mit identischem Untersuchungsmaterial unter verschiedenen Bedingungen (verschiedene Untersucher, verschiedene Gerte, ve
46、rschiedene Laboratorien) zu verschiedenen Zeiten durchgefhrt werden, ist hchs-tens der nach Gleichung (4) berechnete Wert zu erwarten. R = 0,006 82 DZ2 0,237 DZ + 3,490 6 (4) sR= 2,409 9 103 DZ2 0,083 75 DZ + 1,233 4 (5) 9 Untersuchungsbericht Im Untersuchungsbericht sind mindestens anzugeben: a) Hi
47、nweis auf diese Norm; b) Art, Herkunft und Bezeichnung der Probe; c) Art und Datum der Probenahme; d) Eingangs- und Untersuchungsdatum; e) Untersuchungsergebnis; f) Begrndung, falls von dieser Norm abgewichen worden ist. DIN 10750:2009-02 8 Literaturhinweise DIN 12331, Laborgerte aus Glas Becher Schade, J. E., Marsh, G. L. and Eckert, J. E.: Food Research, 23, 1958, S. 446448
