1、August 2015DEUTSCHE NORM DIN-Normenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL)Preisgruppe 11DIN Deutsches Institut fr Normung e. V. Jede Art der Vervielfltigung, auch auszugsweise, nur mit Genehmigung des DIN Deutsches Institut fr Normung e. V., Berlin, gestattet.ICS 67.140.20!%C b
2、) die Soxhlet-Extraktion wurde durch eine verkrzte Extraktion im Ultraschallbad ersetzt; c) statt einer Einpunkt-Kalibrierung wurde eine Mehrpunkt-Kalibrierung vorgeschrieben; d) das Ergebnis wird nicht mehr nur als Summe der Chlorogensuren, sondern als individuell ermittelte, einzelne Massenanteile
3、 verschiedener Chlorogensuren und -derivate angegeben; e) Norm redaktionell berarbeitet. Frhere Ausgaben DIN 10767-1: 1976-10, 1981-12 DIN 10767-2: 1978-06 DIN 10767-3: 1979-10 DIN 10767: 1987-10, 1992-05 DIN 10767:2015-08 4 1 Anwendungsbereich Diese Norm legt ein Verfahren fest zur getrennten Besti
4、mmung der drei mono-Caffeoylchinasuren 3-, 4- und 5-CQA; der drei di-Caffeoylchinasuren 3,4-, 3,5- und 4,5-diCQA; von drei Feruloylchinasuren (3-, 4- und 5-FQA) und von zwei Chlorogensurelactonen (3- und 4-CQL). Beispiele fr Strukturformeln, Bezeichnungen sowie die gebruchlichen Abkrzungen fr bestim
5、mbare Analyte sind in Bild A.1 und in Tabelle A.1 enthalten. Dieses Verfahren ist fr Rstkaffee und Kaffee-Extrakte, die in flssiger und getrockneter Form vorliegen, validiert worden. Es ist jedoch auch prinzipiell fr Rohkaffee geeignet. ANMERKUNG 1 Mit diesem Verfahren werden ausschlielich die im Ka
6、ffee enthaltenen freien Chlorogensuren und -derivate erfasst (siehe Erluterungen). Eine Bestimmung und Berechnung der Massenanteile an weiteren Hydroxyzimtsurederivaten (z. B. Cumaroylchinasuren, Feruloyl-Caffeoylchinasuren und di-Feruloylchinasuren) ist mglich. 2 Normative Verweisungen Die folgende
7、n Dokumente, die in diesem Dokument teilweise oder als Ganzes zitiert werden, sind fr die Anwendung dieses Dokuments erforderlich. Bei datierten Verweisungen gilt nur die in Bezug genommene Ausgabe. Bei undatierten Verweisungen gilt die letzte Ausgabe des in Bezug genommenen Dokuments (einschlielich
8、 aller nderungen). DIN 10764-2, Untersuchung von Kaffee und Kaffee-Erzeugnissen Bestimmung des Massenverlusts von Kaffee-Extrakt Teil 2: Vakuum-Trockenschrank-Verfahren (Routineverfahren) DIN 10764-4, Untersuchung von Kaffee und Kaffee-Erzeugnissen Bestimmung des Massenverlusts von Kaffee-Extrakt Te
9、il 4: Trockenschrankverfahren fr lslichen Kaffee und Kaffeespezialitten bei Normaldruck (Routineverfahren) DIN 10766, Untersuchung von Kaffee und Kaffee-Erzeugnissen Bestimmung des Wassergehalts von Rohkaffee Dioxandestillation, Karl-Fischer-Titration DIN 10772-1, Untersuchung von Kaffee und Kaffee-
10、Erzeugnissen Bestimmung des Wassergehaltes nach Karl Fischer Teil 1: Referenzverfahren fr Rstkaffee DIN 10772-2, Untersuchung von Kaffee und Kaffee-Erzeugnissen Bestimmung des Wassergehaltes nach Karl Fischer Teil 2: Referenzverfahren fr Kaffee-Extrakt DIN 10781, Gemahlener Rstkaffee Bestimmung des
11、Massenverlustes bei 103 C (Routineverfahren zur Ermittlung des Wassergehaltes) DIN ISO 565, Analysensiebe Metalldrahtgewebe, Lochplatten und elektrogeformte Siebfolien Nennffnungsweiten DIN ISO 6673, Rohkaffee Bestimmung des Massenverlusts bei 105C DIN 10767:2015-08 5 3 Begriffe Fr die Anwendung die
12、ses Dokuments gilt der folgende Begriff. 3.1 Gehalt an Chlorogensuren Summe der individuellen Massenanteile von mono- und di-CQA, FQA und CQL, angegeben als 5-CQA in g/100 g der Trockenmasse 4 Kurzbeschreibung Die erforderlichenfalls gemahlene und gesiebte Probe wird im geheizten Ultraschallbad mit
13、einer Methanol-Wasser-Mischung extrahiert und anschlieend membranfiltriert. Die Komponenten werden mittels RP-HPLC getrennt und mit einem UV-Detektor quantifiziert. Die Identifizierung erfolgt durch Vergleich der jeweiligen Retentionszeiten mit denen der betreffenden Standardsubstanz (falls verfgbar
14、), mittels Massenspektrometrie (HPLC-MSn) 4 und UV-Spektren (Beispiel siehe B.3), falls ein HPLC-System mit Diodenarraydetektor verwendet wird. Die Quantifizierung erfolgt nach dem Verfahren der externen Standards ber die Peakflchen, entweder berechnet als 5-CQA oder als die jeweils zur Verfgung ste
15、hende Vergleichssubstanz. 5 Reagenzien Es werden analysenreine Reagenzien verwendet. 5.1 Acetonitril, fr die HPLC (gradient-grade“ oder MS-grade“ sind geeignet). 5.2 Wasser, fr die HPLC. 5.3 Methanol, fr die HPLC. 5.4 Essigsure, fr die HPLC. 5.5 Methanol-Wasser-Mischung Gleiche Volumenanteile von Me
16、thanol, fr die HPLC (5.3), und Wasser (5.2) werden miteinander gemischt. 5.6 Fliemittel A (2% Essigsure) 20 ml Essigsure, fr die HPLC (5.4) werden mit Wasser (5.2) auf 1 000 ml aufgefllt, membranfiltriert und entgast. 5.7 Fliemittel B Acetonitril, fr die HPLC (5.1), filtriert und entgast. 5.8 Chloro
17、gensure Standardlsung (Stammlsung) Etwa 10 mg n-Chlorogensure (5-CQA) (M = 354,32 g/mol) werden auf 0,1 mg in einen 50 ml Messkolben eingewogen und in 45 ml eines Gemisches mit einem Volumenanteil von 25 % Methanol und einem Volumenanteil von 75 % Wasser im Ultraschallbad bei 40 C gelst. Nach dem Ab
18、khlen wird mit Wasser auf 50 ml aufgefllt. Diese Lsung hat eine Massenkonzentration von etwa 200 mg/l und kann direkt nach Membranfiltration in das HPLC-System eingespritzt werden. Die Lsungen sind bei Raumtemperatur mindestens 24 h haltbar. Aus der Stammlsung werden Verdnnungen mit Wasser, wie in T
19、abelle 1 festgelegt, hergestellt. DIN 10767:2015-08 6 Tabelle 1 Verdnnungen der Stammlsung mit Wasser Stammlsung Endvolumen (mit Wasser auffllen) Massenkonzentration ml ml mg/l 5 10 etwa 100 2 10 etwa 40 1 50 etwa 4 1 100 etwa 2 Ein Beispiel fr eine Kalibrierfunktion findet sich in Bild B.1. Falls w
20、eitere Standardsubstanzen vorhanden sind, werden diese in analoger Weise angesetzt. 6 Gerte Es wird die bliche Laborausrstung und speziell die Gerte nach 6.1 bis 6.10 verwendet. 6.1 Kaffeemhle, geeignet zum Mahlen von Rstkaffee-Bohnen. 6.2 Kaffeemhle, geeignet zum Mahlen von Rohkaffee-Bohnen. 6.3 Si
21、ebe, mit Drahtsiebbden, mit Maschenweiten von 0,8 mm, 0,63 mm und 0,25 mm, nach DIN ISO 565, R 20. 6.4 Ultraschallbad, verwendbar bis 60 C. 6.5 Analysenwaage. 6.6 Messkolben, Nennvolumen 10 ml, 50 ml und 1 000 ml. 6.7 Membranfilter, 0,45 m. 6.8 Hochleistungs-Flssigchromatograph, bestehend aus binrer
22、 Pumpe, Probenaufgabevorrichtung, UV Detektor (Wellenlnge 324 nm), bevorzugt Diodenarraydetektor, Auswertungssystem. 6.9 Analytische Trennsule, z. B. Durchmesser von 2 mm bis 5 mm, Lnge von 150 mm bis 250 mm, mit einer Octadecyl-Derivat-Fllung oder Phase hnlicher Polaritt (z. B. Phenyl-Hexyl), Parti
23、kelgre 5 m oder kleiner. 6.10 Mikroliterspritze, bei manueller Injektion. 7 Durchfhrung 7.1 Vorbereitung der Probe 7.1.1 Rohkaffee Der Rohkaffee wird mit einer Mhle (6.2) gemahlen und anschlieend mit dem Sieb (6.3) mit der Maschenweite 0,8 mm gesiebt. Fr die Analyse ist die Kornfraktion mit Teilchen
24、gren von weniger als 0,8 mm zu verwenden, ebenso fr die Bestimmung des Wassergehaltes, nach DIN ISO 6673 oder alternativ nach DIN 10766. DIN 10767:2015-08 7 7.1.2 Rstkaffee Der Rstkaffee wird mit der Kaffeemhle (6.1) gemahlen und anschlieend durch die Siebe (6.3) mit den Maschenweiten 0,63 mm und 0,
25、25 mm gesiebt. Die Einwaage fr die Bestimmung wird mit dem Teil der Probe zwischen den beiden Sieben vorgenommen, ebenso fr die Bestimmung des Wassergehaltes, nach DIN 10781 oder alternativ nach DIN 10772-1. 7.1.3 Kaffee-Extrakt Eine Vermahlung von Kaffee-Extrakt ist im Regelfall nicht erforderlich.
26、 Die Bestimmung des Wassergehaltes erfolgt nach DIN 10764-2 oder alternativ nach DIN 10772-2 bzw. nach DIN 10764-4. 7.2 Herstellen der Probelsung 7.2.1 Rohkaffee und Rstkaffee In einen 100 ml Erlenmeyerkolben werden 0,2 g Kaffee auf 0,1 mg eingewogen, mit 25 ml Methanol-Wasser-Gemisch (gleicher Volu
27、menanteil (1 + 1) (5.5) versetzt und 15 min bei 60 C im Ultraschallbad extrahiert. Die Extraktionslsung wird in einen 50 ml Messkolben (6.6) abdekantiert, der Rckstand unter den gleichen Bedingungen erneut extrahiert und die Extraktionslsungen im 50 ml Messkolben vereinigt. Nach dem Abkhlen auf Raum
28、temperatur wird der Kolben mit Wasser zur Marke aufgefllt und der Kolbeninhalt gemischt. Ein Aliquot wird membranfiltriert (0,45 m) und 5 l bis 50 l des Filtrats in das HPLC-System injiziert. 7.2.2 Kaffee-Extrakt 0,1 g bis 0,2 g Kaffee-Extrakt werden auf 0,1 mg direkt in einen 100 ml Erlenmeyerkolbe
29、n eingewogen und mit 40 ml siedendem Wasser bergossen. Falls erforderlich, wird die Probe zum vollstndigen Lsen kurz aufgekocht. Nach dem Abkhlen auf Raumtemperatur wird der Inhalt unter Nachsplen mit Methanol quantitativ in einen 50 ml Messkolben berfhrt und dieser bis zur Marke aufgefllt. Der Kolb
30、eninhalt wird mehrmals geschttelt und ber einen 0,45 m Membranfilter filtriert. 5 l bis 20 l des Filtrats werden eingespritzt. 7.3 Hochleistungsflssigkeitschromatographie (HPLC) Beispiel fr chromatographische Bedingungen: Sule: Zorbax Eclipse XDB-C181), 3,5 m (150 mm 4,6 mm oder 2,1 mm im Durchmesse
31、r (i.D.) oder andere Sule mit RP-18 oder hnlich polarem Material; Eluenten: A: 2 %ige Essigsure (aq.), B: Acetonitril; Gradient: 5 % B, 9 min isokratisch, in 2,5 min auf 9 % B, 10 min isokratisch, in 38,5 min auf 25 % B, 15 min isokratisch, in 5 min auf 5 % B, 20 min isokratisch (Bei Verwendung eine
32、r anderen Sule als der angegebenen muss der Gradient ggf. angepasst werden.); Fluss: 1 ml/min, bei Verwendung von Sulen mit 2 mm i.D. 0,25 ml/min; Detektion: 324 nm (und falls mglich 272 nm, um Coffein zu erkennen); Die Parameter sollten so gewhlt werden, dass sich ein gut aufgelstes Chromatogramm e
33、rgibt. Die Elutionsreihenfolge ist auf unterschiedlichen RP-18 Materialien verschieden. Whrend die 3-CQA immer als erste der mono-CQA eluiert wird, kann die Elutionsreihenfolge der 4- und der 5-CQA unterschiedlich sein. Dies gilt auch fr die di-CQA. Die Retentionszeit der 5-CQA kann durch eine Refer
34、enzsubstanz ermittelt werden. Ein Beispielchromatogramm ist in B.2 dargestellt. 1) Die genannte Sule ist ein Beispiel fr ein geeignetes handelsbliches Produkt. Diese Angabe dient nur zur Unterrichtung der Anwender dieser Norm und bedeutet keine Anerkennung der genannten Produkte durch das DIN. DIN 1
35、0767:2015-08 8 8 Auswertung 8.1 Berechnung Zur Berechnung der Massenanteile an den mono- und di-CQA, FQA und CQL wird eine Kalibriergerade der jeweils verfgbaren Referenzverbindungen zugrunde gelegt. Hilfsweise kann eine Kalibriergerade der 5-CQA benutzt werden. Bei der Angabe der Ergebnisse muss da
36、nn berechnet als 5-CQA“ angegeben werden. Die Werte fr die di-Caffeoylchinasuren werden mit Hilfe eines Faktors umgerechnet, siehe 5. Dieser wird aus dem Verhltnis der Extinktionskoeffizienten gewonnen: 77,0CQAdiCQAmono=Der Massenanteil der einzelnen Analyten iw wird mit der folgenden Gleichung bere
37、chnet: DM100)(wmafVbAwii= Dabei ist iw der Massenanteil des CQA-Derivats, in Prozent, bezogen auf die Probentrockenmasse; Aidie Flche des jeweils zu bestimmenden CQA-Derivats, in Flcheneinheiten (FE); b der Achsenabschnitt der Kalibriergerade des jeweiligen Referenzmaterials bzw. der 5-CQA, in FE; f
38、 der Umrechnungsfaktor zur Bercksichtigung der unterschiedlichen Extinktionskoeffizienten bei den zu bestimmenden Analyten (1 fr mono-CQA, 0,77 fr di-CQA und di-FQA), dimensionslos; V die kombinierten Extraktionslsungen (nach 7.2.1 oder 7.2.2), in ml (z. B. 50 ml); a die Steigung der Kalibriergerade
39、 des jeweiligen Referenzmaterials oder der 5-CQA, in mglFE; m die Probeneinwaage, in g; DMw der Trockenmassenanteil der Probe, in Prozent (OH2100 w= mit OH2w als Massenanteil des Wassers der Probe, in Prozent). Das Ergebnis wird auf zwei Stellen nach dem Komma gerundet angegeben. DIN 10767:2015-08 9
40、 8.2 Przision des Verfahrens 8.2.1 Allgemeines Ein Ringversuch, der unter Beteiligung von zehn Laboratorien mit 2 Rstkaffees und 2 Kaffee-Extrakten im Jahr 2012 nach DIN ISO 5725-1, DIN ISO 5725-2 und DIN ISO 5725-6 durchgefhrt wurde, ergab fr dieses Verfahren die in den Tabellen 2 bis 5 dargestellt
41、en Przisionsdaten. Die aus diesem Ringversuch abgeleiteten Werte knnen auf andere Konzentrationsbereiche und Matrices als die in den Tabellen 2 bis 5 angegebenen, nicht angewendet werden. 8.2.2 Wiederholprzision Die absolute Differenz zwischen zwei voneinander unabhngigen einzelnen Untersuchungserge
42、bnissen, die unter Anwendung desselben Verfahrens an identischem Untersuchungsmaterial im selben Laboratorium durch denselben Bearbeiter mit derselben Gerteausrstung in kurzen Zeitabstnden erhalten wurde, wird in nicht mehr als 5 % der Flle die in den Tabellen 2 bis 5 angegebenen Werte von r berschr
43、eiten. 8.2.3 Vergleichprzision Die absolute Differenz zwischen zwei einzelnen Untersuchungsergebnissen, die unter Anwendung desselben Verfahrens an identischem Untersuchungsmaterial in verschiedenen Laboratorien von verschiedenen Bearbeitern mit verschiedenen Gerten erhalten wurde, wird in nicht meh
44、r als 5 % der Flle die in den Tabellen 2 bis 5 angegebenen Werte von R berschreiten. DIN 10767:2015-08 10 Tabelle 2 Przisionsdaten zur Bestimmung von Chlorogensuren und chlorogensurehnlichen Verbindungen in Kaffee Probe 1 (Rstkaffee) Statistische Kenngre 3-CQA 5-CQA 4-CQA 3-FQA 5-FQA 4-FQA 3-CQL 4-C
45、QL 3,4-diCQA 3,5-diCQA 4,5-diCQA Anzahl der teilnehmenden Laboratorien 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 Anzahl Ausreierlaboratorien 0 0 0 0 0 1 1 2 2 1 0 Anzahl Laboratorien zur Ermittlung der Kenngren 10 10 10 10 10 9 9 8 8 9 10 Mittelwert 2,066 4,398 2,506 0,364 0,960 0,462 1,561 0,814 0,232 0,156
46、 0,244 95 %-Vertrauensbereich, g/kg 0,047 0,086 0,069 0,045 0,142 0,087 0,216 0,066 0,035 0,033 0,026 Vergleich-Standardabweichung sR, g/kg 0,079 0,143 0,110 0,072 0,226 0,132 0,326 0,095 0,049 0,052 0,041 Relative Vergleich-Standardabweichung sR,rel, % 3,84 3,26 4,40 19,79 23,48 28,68 20,90 11,67 2
47、1,13 33,27 16,90 Vergleichgrenze R, g/kg 0,222 0,401 0,309 0,201 0,631 0,371 0,914 0,266 0,137 0,146 0,115 Relative Vergleichgrenze Rrel, % 10,76 9,12 12,33 55,40 65,75 80,31 58,53 32,67 59,17 93,16 47,32 Wiederhol-Standardabweichung sr, g/kg 0,033 0,053 0,024 0,012 0,027 0,025 0,053 0,023 0,006 0,0
48、19 0,008 Relative Wiederhol-Standardabweichung sr,rel, % 1,59 1,19 0,96 3,33 2,78 5,45 3,38 2,83 2,64 12,19 3,18 Wiederholgrenze r, g/kg 0,092 0,147 0,067 0,034 0,075 0,070 0,148 0,064 0,017 0,053 0,022 Relative Wiederholgrenze rrel, % 4,45 3,34 2,69 9,32 7,79 15,26 9,45 7,91 7,39 34,13 8,90 Relativ
49、e Horwitz-Standardabweichung, % 5,07 4,53 4,93 6,59 6,35 6,35 5,29 5,83 7,05 7,48 7,00 HORRAT 0,76 0,72 0,89 3,00 4,51 4,51 3,95 2,00 3,00 4,45 2,42 DIN 10767:2015-08 11 Tabelle 3 Przisionsdaten zur Bestimmung von Chlorogensuren und chlorogensurehnlichen Verbindungen in Kaffee Probe 2 (Rstkaffee) Statistische
