1、DEUTSCHE NORM September 2000Untersuchung von Tee und Tee-ErzeugnissenBestimmung des Gehaltes an Theobromin undCoffein von fl ssigen Teegetr nkenTeil 1: HPLC-RoutineverfahrenD10811-1ICS 67.140.10Analysis of tea and tea products Determination oftheobromine and caffeine content of fluid tea drinks Part
2、 1: HPLC-Routine-methodAnalyse du th et des derivs Dterminationdelateneuren theobromine et cafine de boisons de th fluides Partie 1: Mthode de routine de HPLCVorwortDiese Norm wurde vom Normenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte, Arbeits-ausschuss Tee , erarbeitet.Die Reihe DIN 10
3、811 Untersuchung von Tee und Tee-Erzeugnissen Bestimmung des Gehaltes anTheobromin und Coffein von fl ssigen Teegetr nken besteht aus:Teil 1: HPLC-RoutineverfahrenTeil 2: HPLC-Referenzverfahren (auch f r geringe Gehalte an Theobromin)1 AnwendungsbereichDiese Norm legt ein hochleistungsfl ssigchromat
4、ographisches (HPLC) Routineverfahren f r dieBestimmung des Theobromingehaltes und des Coffeingehaltes von fl ssigen Teegetr nken, wie z. B.fruchthaltige und/oder aromatisierte Teegetr nke, fest.Bei einer Massenkonzentration an Theobromin unter 2 mg=l ist DIN 10811-2 anzuwenden.2 Normative Verweisung
5、enDiese Norm enth lt durch datierte oder undatierte Verweisungen Festlegungen aus anderen Publi-kationen. Diese normativen Verweisungen sind an den jeweiligen Stellen im Text zitiert, und diePublikationen sind nachstehend aufgef hrt. Bei datierten Verweisungen geh ren sp tere nderungenoder berarbeit
6、ungen dieser Publikationen nur zu dieser Norm, falls sie durch nderung oder berar-beitung eingearbeitet sind. Bei undatierten Verweisungen gilt die letzte Ausgabe der in Bezuggenommenen Publikation.DIN ISO 3696, Wasser f r analytische Zwecke Anforderungen und Pr fungen; Identisch mitISO 3696:1987.Fo
7、rtsetzungSeite2bis6Normenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL) im DINDeutsches Institut f r Normung e.V. DIN Deutsches Institut f r Normung e.V. Jede Art der Vervielf ltigung, auch auszugsweise,nur mit Genehmigung des DIN Deutsches Institut f r Normung e.V., Berlin, gestattet
8、.Alleinverkauf der Normen durch Beuth Verlag GmbH, 10772 BerlinRef.-Nr. DIN 10811-1:2000-09Preisgr. 07 Vertr.-Nr. 00073 DefinitionenF r die Anwendung dieser Norm gelten die folgenden Definitionen:3.1Theobromingehalt von fl ssigen Teegetr nkender nach dem hier festgelegten Verfahren bestimmte Theobro
9、mingehalt, angegeben als Massenkonzen-tration in Milligramm je Liter Teegetr nk3.2Coffeingehalt von fl ssigen Teegetr nkender nach dem hier festgelegten Verfahren bestimmte Coffeingehalt, angegeben als Massenkonzentrationin Milligramm je Liter Teegetr nk4PrinzipDie Probe wird ber einen Anionenaustau
10、scher vorgereinigt. Nach Filtration wird der Theobromingehaltund der Coffeingehalt durch Hochleistungsfl ssigchromatographie und mit Hilfe eines UV-Detektorsbestimmt.5 ChemikalienEs sind analysenreine Chemikalien zu verwenden. Das verwendete Wasser muss der Qualit t 1 nachDIN ISO 3696 entsprechen.5.
11、1 Methanol, geeignet f r HPLC5.2 Methanol5.3 Stark basischer AnionenaustauscherCl-Form, 75 m bis 150 m (100 mesh bis 200 mesh)1)Bei Verwendung jeder neuen Charge sollte diese in Wiederfindungsversuchen gepr ft werden. DieWiederfindungsrate sollte ber 95 % liegen.5.4 Phosphat-Pufferl sung2,76 g Natri
12、umdihydrogenphosphat-Monohydrat NaH2PO4 H2O werden in einem 200-ml-Becherglasin etwa 100 ml Wasser gel st. Diese L sung wird mit Phosphors ure c H3PO4= 0,2 mol=l auf einenpH-Wert von 4,0 eingestellt. Anschlie end wird die L sung in einen 1 000-ml-Messkolben bergef hrt,mit 300 ml Methanol nach 5.2 ve
13、rsetzt und mit Wasser bis zur Strichmarke aufgef llt.5.5 Flie mittel, Methanol-Wasser-Mischung (z. B. 30 : 70 Volumenanteile)600 ml Methanol nach 5.1 werden in einen 2 000-ml-Messkolben gegeben. Der Messkolben wird mitWasser aufgef llt. Anschlie end wird durch Sch tteln gemischt.5.6 Theobromin-Stamm
14、l sung50 mg Theobromin werden in einen 200-ml-Messkolben auf 0,1 mg eingewogen, in etwa 60 ml Methanolunter Erw rmen im kochenden Wasserbad gel st und nach dem Temperieren der L sung auf 20 C biszur Strichmarke mit Wasser aufgef llt. Diese L sung ist im K hlschrank mindestens 3 Wochen haltbar.Seite
15、2DIN 10811-1:2000-091)Die Angabe der K rnung wurde nach BS 410:1986 Specification for test sieves in die SI-Einheit m bertragen.5.7 Coffein-Stamml sung100 mg Coffein werden in einen 100-ml-Messkolben auf 0,1 mg eingewogen, mit 50 ml Wasser versetztund im Ultraschallbad gel st. Nach Temperieren der L
16、 sung auf 20 C wird mit Wasser bis zur Strich-marke aufgef llt.Diese L sung ist bei Lagerung im K hlschrank einen Monat verwendbar.5.8 Theobromin-Coffein-Standardl sungAus den Stamml sungen nach 5.6 und 5.7 wird durch Verd nnen mit dem Flie mittel nach 5.5 eineTheobromin-Coffein-Standardl sung herge
17、stellt. F r die Einpunkt-Kalibrierung wird vorzugsweise miteiner Standardl sung mit 1 mg Theobromin und 20 mg Coffein je Liter gearbeitet. Die ben tigte Mengean Standardl sung wird vor der Verwendung durch ein Membranfilter nach 6.3 filtriert.6 Ger tebliche Laboratoriumsger te, insbesondere Ger te n
18、ach 6.1 bis 6.7.6.1 Hochleistungsfl ssigchromatograph, ausgestattet mit einem UV-Detektor oder einem Dioden-array-Detektor sowie mit einem Auswertsystem.6.2 Analytische Trenns ule aus Stahl, z. B. Durchmesser 4,0 mm bzw. 4,6 mm, L nge 250 mm,miteiner Octadecyl-Derivat-F llung oder einer Octyl-Deriva
19、t-F llung, Korngr e z. B. 5 m.Zus tzlich kann eine Vors ule mit dem gleichen F llmaterial der Trenns ule verwendet werden.6.3 Membranfiltriereinrichtung mit einem 0,45- m-Membranfilter f r w ssrige L sungen.6.4 Ultraschallbad6.5 Glass ule mit 10 mm bis 15 mm Innendurchmesser und Hahn, m glichst mit
20、grober Fritte.6.6 Magnetr hrer6.7 Mikroliterspritze7 Durchf hrung7.1 Vorreinigung der Probenl sungDie Glass ule nach 6.5 wird unten mit einem Wattebausch verschlossen. Dabei wird die Watte leichtangedr ckt, damit eine ebene Oberfl che erreicht wird.Anschlie end wird 1 g des Anionenaustauschers nach
21、5.3 trocken in die S ule eingef llt. Die S ulen-f llungwirdmit50 ml Wasser gesp lt. Dabei werden eventuell an der S ulenwand anhaftende Ionenaus-tauscherharz-Partikel abgesp lt. Die F llung wird mit einem d nnen Wattebausch derartig abgedeckt,dass eine ebene Schicht entsteht.Es wird soviel Wasser ab
22、gelassen, bis das Wasser die Watteschicht gerade noch bedeckt. Dabei ist dar-auf zu achten, dass die S ule nicht trockenl uft.Anschlie end wird ein 25-ml-Messkolben unter den Auslauf der S ule gestellt. Auf die vorbereiteteS ule werden mit einer Vollpipette 10 ml der gut durchmischten Probe pipettie
23、rt und langsam durch dieS ule laufen gelassen, bis noch 1 mm der Probe ber der Watte steht. Dabei ist wieder darauf zu achten,dass die S ule nicht trocken l uft.Seite 3DIN 10811-1:2000-09Anschlie end wird die S ule mit der Phosphat-Pufferl sung nach 5.4 gesp lt, bis der 25-ml-Messkolbenfast bis zur
24、Strichmarke gef llt ist. Die Elutionsgeschwindigkeit sollte dabei zwei Tropfen je s nicht ber-schreiten. Der Messkolben wird anschlie end auf 20 C temperiert und mit Wasser bis zur Strichmarkeaufgef llt. Die vorgereinigte Probenl sung wird durch ein Membranfilter nach 6.3 filtriert. Das Filtrat wird
25、unverd nnt zur Bestimmung eingesetzt.7.2 BestimmungDer Hochleistungsfl ssigchromatograph (6.1) wird anhand der Herstelleranweisung in Betrieb gesetzt.Die HPLC-Bedingungen werden zweckentsprechend, z. B. wie folgt dargestellt, gew hlt:Flie mittel: Methanol-Wasser-Mischung, z. B. 30 : 70 Volumenanteil
26、e (isokratisch)Flie geschwindigkeit: 0,8 ml=min bis 1,0 ml=minDetektion: UV im Bereich des Absorptionsmaximums (270 nm bis 272 nm)Injektionsvolumen: bei 5 m Korngr e z. B. 20 lDie HPLC-Bedingungen sollten soweit optimiert werden, dass im Chromatogramm eine ausreichendeTrennleistung erkennbar ist. In
27、sbesondere sollte der Theobrominpeak eindeutig von St rpeaks der Pro-benmatrix abgetrennt worden sein.Die Linearit t der Kalibriergeraden im Arbeitsbereich ist durch Mehrpunktkalibrierung sicherzustellen.8 AuswertungDie Auswertung erfolgt mit dem Verfahren des externen Standards. Bei Einpunktkalibri
28、erung wirdder Theobromingehalt, angegeben als Massenkonzentration vTin Milligramm je Liter Teegetr nk, nachfolgender Zahlenwertgleichung berechnet:vT=ATBT cTmKmE=ATBT cT 2,5 1 Dabei ist:ATFl che des Theobrominpeaks bei Messung der Probenl sung, in Fl cheneinheitenBTFl che des Theobrominpeaks bei Mes
29、sung der Standardl sung nach 5.8, in Fl cheneinheitencTKonzentration der Standardl sung an Theobromin, in Milligramm je LitermEProbenmenge, in Milliliter (10 ml)mKVolumen des Messkolbens (Probenl sung nach 7.1, entspricht 25 ml)Der Coffeingehalt, angegeben als Massenkonzentration vCin Milligramm je
30、Liter Teegetr nk, wird nachfolgender Zahlenwertgleichung berechnet:vC=ACBC cCmKmE=ACBC cC 2,5 2 Dabei ist:ACFl che des Coffeinpeaks bei Messung der Probenl sung, in Fl cheneinheitenBCFl che des Coffeinpeaks bei Messung der Standardl sung nach 5.8, in Fl cheneinheitencCKonzentration der Standardl sun
31、g an Coffein, in Milligramm je LitermEProbenmenge, in Milliliter (10 ml)mKVolumen des Messkolbens (Probenl sung nach 7.1, entspricht 25 ml)Der Theobromingehalt (vT) wird auf zwei signifikante Stellen, der Coffeingehalt (vC) auf drei signifikanteStellen gerundet, angegeben.Seite 4DIN 10811-1:2000-099
32、 Pr zision des Verfahrens9.1 RingversuchEinzelheiten des Ringversuchs zur Pr zision des Verfahrens sind in Anhang A zusammengefasst. DerRingversuch wurde an zwei verschiedenen Eistees Typ Pfirsich (Probe A und Probe B) durchgef hrt.Die aus diesen Untersuchungen abgeleiteten Werte m ssen nicht unbedi
33、ngt auf andere Konzentrations-bereiche und Matrizes als die angegebenen anwenbar sein.9.2 Wiederholpr zisionDie absolute Differenz zwischen zwei voneinander unabh ngigen einzelnen Pr fergebnissen, die der-selbe Bearbeiter an identischem Probenmaterial nach dem gleichen Verfahren in demselben Labora-
34、torium mit denselben Ger ten innerhalb einer kurzen Zeitspanne erh lt, sollte folgende Werte nichtberschreiten:F r Coffein:F r Theobromin:9.3 Vergleichpr zisionDie absolute Differenz zwischen zwei voneinander unabh ngigen Pr fergebnissen, die unter Anwendungdes gleichen Verfahrens an identischem Pro
35、benmaterial in verschiedenen Laboratorien durch verschie-dene Bearbeiter unter Verwendung verschiedener Ger teausr stungen gewonnen wurde, sollte folgendeWerte nicht berschreiten:F r Coffein:F r Theobromin:10 UntersuchungsberichtIm Untersuchungsbericht sind unter Hinweis auf diese Norm anzugeben:a)
36、Art, Herkunft und Bezeichnung der Probe;b) Art und Datum der Probenahme;c) Massenkonzentration an Theobromin in Milligramm je Liter Teegetr nk;d) Massenkonzentration an Coffein in Milligramm je Liter Teegetr nk;e) Untersuchungsdatum;f) gegebenenfalls Abweichungen von den Festlegungen dieser Norm.Sei
37、te 5DIN 10811-1:2000-09Probe A Probe Bx = 66,3 mg=l x = 100 mg=lr = 2,80 mg=l r = 2,69 mg=lProbe A Probe Bx = 3,5 mg=l x = 5,3 mg=lr = 0,24 mg=l r = 0,24 mg=lProbe A Probe Bx = 66,3 mg=l x = 100 mg=lR = 6,68 mg=l R = 12,7 mg=lProbe A Probe Bx = 3,5 mg=l x = 5,3 mg=lR = 0,79 mg=l R = 1,3 mg=lAnhang A
38、(informativ)Statistische Ergebnisse des RingversuchsEin im Jahre 1996 unter Beteiligung von acht Laboratorien durchgef hrter Ringversuch ergab diein Tabelle A.1 dargestellten Pr zisionsdaten. Die Durchf hrung und Auswertung erfolgte nachDIN ISO 5725:1988-04 1.Literaturhinweise1 DIN ISO 57252), Pr zi
39、sion von Messverfahren Ermittlung der Wiederhol- und Vergleichpr zisionvon festgelegten Messverfahren durch Ringversuche; Identisch mit ISO 5725, Ausgabe 1986Seite 6DIN 10811-1:2000-09Tabelle A.1 Statistische Ergebnisse des RingversuchsProbe Probe A Probe BParameter Theobromin Coffein Theobromin Cof
40、feinAnzahl der Laboratorien 8 8 8 8Anzahl der Eliminierungen Mittelwert x (mg=l) 3,473 66,336 5,260 100,109Wiederholstandardabweichung sr(mg=l) 0,084 0,989 0,084 0,952Wiederholgrenze r (mg=l) 0,239 2,800 0,238 2,693Vergleichstandardabweichung sR(mg=l) 0,279 2,362 0,446 4,479Vergleichgrenze R (mg=l) 0,791 6,684 1,262 12,6752)DIN ISO 5725:88-04 (ersetzt durch DIN ISO 5725-1:1997-11 und E DIN ISO 5725-2:1991-02) wurde zur Ermitt-lung der Pr zisionsdaten verwendet.
