1、Oktober 2010DEUTSCHE NORM Normenausschuss Wasserwesen (NAW) im DINPreisgruppe 12DIN Deutsches Institut fr Normung e.V. Jede Art der Vervielfltigung, auch auszugsweise, nur mit Genehmigung des DIN Deutsches Institut fr Normung e.V., Berlin, gestattet.ICS 13.060.70!$jRE“1714734www.din.deDDIN 38412-3De
2、utsche Einheitsverfahren zur Wasser-, Abwasser- undSchlammuntersuchung Testverfahren mit Wasserorganismen (Gruppe L) Teil 3: Toxizittstest zur Bestimmung derDehydrogenasenaktivittshemmung in Belebtschlamm (TTC-Test) (L 3)German standard methods for the examination of water, waste water and sludge Bi
3、o-assays (group L) Part 3: Toxicity test for assessing the inhibition of the dehydrogenase activity of activatedsludge microorganisms (TTC-Test) (L 3)Mthodes normalises allemandes pour lanalyse des eaux, des eaux rsiduaires et desboues Essais biologiques (groupe L) Partie 3: Essai de toxicit pour lv
4、aluation de linhibition de lactivit de dhydrognasedes micro-organismes des boues actives (TTC-Test) (L 3)Alleinverkauf der Normen durch Beuth Verlag GmbH, 10772 Berlin www.beuth.deGesamtumfang 22 SeitenB55EB1B3E14C22109E918E8EA43EDB30F09DCEB7EE8ED9NormCD - Stand 2010-10 DIN 38412-3:2010-10 Inhalt Se
5、ite Vorwort 4 Einleitung 5 1 Anwendungsbereich .6 2 Normative Verweisungen .6 3 Begriffe .6 4 Grundlage des Verfahrens .7 5 Strungen.7 5.1 Allgemeines .7 5.2 Testgut, das Formazan entfrbt.7 5.3 Testgut mit Eigenfrbung.7 5.4 Prfung des Testgutes mit reduzierenden Eigenschaften8 5.5 Lipophile Stoffe .
6、8 6 Bezeichnung 8 7 Reagenzien.8 8 Belebtschlamm10 8.1 Allgemeines .10 8.2 Vorbereitung des Belebtschlamms .10 9 Gerte .11 10 Probenahme und Probentransport11 11 Durchfhrung.11 11.1 Probenvorbereitung des Testgutes.11 11.2 Testdurchfhrung12 12 Gltigkeitskriterien14 13 Berechnung14 14 Angabe der Erge
7、bnisse 15 15 Prfbericht .15 16 Verfahrenskenndaten16 Anhang A (informativ) Verfahrensvariante unter Anwendung der Filtrationstechnik .17 A.1 Allgemeines .17 A.2 Strungen.17 A.3 Reagenzien.17 A.4 Belebschlamm .17 A.5 Gerte .17 A.6 Probenahme und Probentransport18 A.7 Durchfhrung.18 A.8 Gltigkeit 19 A
8、.9 Berechnung der prozentualen Hemmung bei Messung der Extinktion.19 A.10 Angabe des Ergebnisses19 A.11 Prfbericht .19 A.12 Verfahrenskenndaten20 Anhang B (informativ) Erluterungen.21 Literaturhinweise.22 2 B55EB1B3E14C22109E918E8EA43EDB30F09DCEB7EE8ED9NormCD - Stand 2010-10 DIN 38412-3:2010-10 Seit
9、e Tabellen Tabelle 1 Belebtschlamm-Anstze 10 Tabelle 2 Ansatzreihe 13 Tabelle 3 Verfahrenskenndaten nach DIN 38402-42 fr die Bestimmung der Dehydrogenasenaktivitt . 16 Tabelle A.1 Verfahrenskenndaten nach DIN 38402-42 fr die Bestimmung der Dehydrogenasenaktivitt nach der Filtrationstechnik 20 3 B55E
10、B1B3E14C22109E918E8EA43EDB30F09DCEB7EE8ED9NormCD - Stand 2010-10 DIN 38412-3:2010-10 Vorwort Dieses Dokument wurde vom Arbeitskreis NA 119-01-03-05-08 AK TTC-Test“ des Arbeitsausschusses NA 119-01-03 AA Wasseruntersuchung“ im Normenausschuss Wasserwesen (NAW) erarbeitet. Es wird auf die Mglichkeit h
11、ingewiesen, dass einige Texte dieses Dokuments Patentrechte berhren knnen. Das DIN ist nicht dafr verantwortlich, einige oder alle diesbezglichen Patentrechte zu identifizieren. Diese Norm ist Bestandteil der Reihe Deutsche Einheitsverfahren zur Wasser-, Abwasser- und Schlammuntersuchung Testverfahr
12、en mit Wasserorganismen (Gruppe L) Toxizittstest zur Bestimmung der Dehydrogenasenaktivittshemmung in Belebtschlamm (TTC-Test) (L 3). Diese Norm wurde gemeinsam mit der Wasserchemischen Gesellschaft eine Fachgruppe in der Gesellschaft Deutscher Chemiker aufgestellt (siehe Anhang B). Es ist erforderl
13、ich, bei den Untersuchungen nach dieser Norm Fachleute oder Facheinrichtungen einzu-schalten und bestehende Sicherheitsvorschriften zu beachten. Bei Anwendung der Norm ist im Einzelfall je nach Aufgabenstellung zu prfen, ob und inwieweit die Festlegung zustzlicher Randbedingungen erforderlich ist. Z
14、u DIN 38412 Deutsche Einheitsverfahren zur Wasser-, Abwasser- und Schlammuntersuchung Testver-fahren mit Wasserorganismen (Gruppe L)“ gehren weitere Teile. Eine bersicht der Gruppen A bis T der Deutschen Einheitsverfahren“ enthlt Anhang B. WARNUNG Anwender dieser Norm sollten mit der blichen Laborpr
15、axis vertraut sein. Diese Norm gibt nicht vor, alle unter Umstnden mit der Anwendung des Verfahrens verbundenen Sicherheitsaspekte anzusprechen. Es liegt in der Verantwortung des Anwenders, angemessene Sicherheits- und Schutzmanahmen zu treffen und sicherzustellen, dass diese mit nationalen Festlegu
16、ngen bereinstimmen. 4 B55EB1B3E14C22109E918E8EA43EDB30F09DCEB7EE8ED9NormCD - Stand 2010-10 DIN 38412-3:2010-10 Einleitung Mikroorganismen enthalten Enzyme (Biokatalysatoren), die den Abbau der Abwasserinhaltsstoffe bewirken. Eine Gruppe dieser Enzyme sind die Dehydrogenasen; sie spalten von den Subs
17、tanzen (Abwasserinhalts-stoffen) Wasserstoffatome ab. Je mehr Dehydrogenasen im Belebtschlamm enthalten sind, desto aktiver ist der Schlamm. Nach diesem Verfahren wird durch die Dehydrogenaseaktivitt der lebenden Zellen im Belebtschlamm aus Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) Triphenylformazan (TPF) g
18、ebildet. Da die Dehydro-genasenaktivitt mit dem Tod der Zellen erlischt, ist Anwesenheit und Menge an gebildetem TPF ein Ma fr die Schlammaktivitt. SICHERHEITSVORKEHRUNGEN Belebtschlmme und Abwsser knnen potentiell pathogene Organismen enthalten. Daher mssen geeignete Vorsichtsmanahmen ergriffen wer
19、den, wenn mit ihnen umgegangen wird. Toxische Testsubstanzen und solche mit unbekannten Eigenschaften mssen mit Vorsicht gehandhabt werden. 5 B55EB1B3E14C22109E918E8EA43EDB30F09DCEB7EE8ED9NormCD - Stand 2010-10 DIN 38412-3:2010-10 1 Anwendungsbereich Diese Norm legt ein Verfahren zur Abschtzung der
20、akuten Hemmwirkung eines Testgutes auf hauptschlich heterotrophe Bakterien aus Belebtschlamm kommunaler und/oder industrieller Abwasserbehandlungsanlagen fest. Die Hemmwirkung wird nach einer Inkubationszeit von 1 h bestimmt. Das Verfahren ist auf Abwasser und nicht flchtige, wasserlsliche chemische
21、 Stoffe anwendbar. Es knnen auch unlsliche Stoffe erfasst werden, wenn sorgfltig darauf geachtet wird, dass das Testgemisch homogen ist. Das Verfahren erlaubt neben der Bestimmung toxischer Effekte auch die quantitative Ermittlung der biochemischen Aktivitt eines Inokulums. 2 Normative Verweisungen
22、Die folgenden zitierten Dokumente sind fr die Anwendung dieses Dokuments erforderlich. Bei datierten Verweisungen gilt nur die in Bezug genommene Ausgabe. Bei undatierten Verweisungen gilt die letzte Ausgabe des in Bezug genommenen Dokuments (einschlielich aller nderungen). DIN 38402-51, Deutsche Ei
23、nheitsverfahren zur Wasser-, Abwasser und Schlammuntersuchung Allgemeine Angaben (Gruppe A) Kalibrierung von Analysenverfahren, Auswertung von Analysenergebnissen und lineare Kalibrierfunktionen fr die Bestimmung von Verfahrenskenngren (A 51) DIN EN ISO 5667-16, Wasserbeschaffenheit Probenahme Teil
24、16: Anleitung zur Probenahme und Durchfhrung biologischer Testverfahren DIN ISO 3696, Wasser fr analytische Zwecke Anforderungen und Prfungen DIN ISO 23753-1, Bodenbeschaffenheit Bestimmung der Dehydrogenaseaktivitt in Bden Teil 1: Verfahren mit Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) 3 Begriffe Fr die An
25、wendung dieses Dokuments gelten die folgenden Begriffe. 3.1 Belebtschlamm zusammengeballte Biomasse (Flocken), die sich in Abwasser durch die Ttigkeit von Bakterien und anderen Mikroorganismen bei Vorhandensein von gelstem Sauerstoff bildet ISO 6107-1:2004, 2 3.2 Inhibitionskontrollansatz Ansatz zur
26、 Inhibition mit Dichlorphenol (DCP) 3.3 Nhrmedium wssrige Lsung von Nhrstoffen, die fr das Bakterienwachstum notwendig sind DIN 38412-37:1999-04, 3.6 3.4 Nhrmedium-Referenzansatz Ansatz zur Aktivierung mit Nhrmedium 6 B55EB1B3E14C22109E918E8EA43EDB30F09DCEB7EE8ED9NormCD - Stand 2010-10 DIN 38412-3:2
27、010-10 3.5 Testansatz Anstze mit dem zu prfenden Testgut mit Triphenyltetrazoliumchlorid-Lsung 3.6 Testgut definierte Substanz, Mischung, chemisches Produkt oder Abwsser, die geprft werden sollen 3.7 berstandswasser Wasser, das durch Zentrifugieren, Sedimentieren oder Filtrieren des Belebtschlamms g
28、ewonnen wird 3.8 berstandswasser-Kontrollansatz Ansatz mit dem im berstandswasser verbliebenen Belebtschlamm, mit Triphenyltetrazoliumchlorid-Lsung versetzt 3.9 Verdnnungswasser-Kontrollansatz in Verdnnungswasser aufgenommener Belebtschlamm, mit Triphenyltetrazoliumchlorid-Lsung versetzt 4 Grundlage
29、 des Verfahrens Farbloses, wasserlsliches Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC), welches als Indikatorsubstanz dient, wird mit Hilfe der im Belebtschlamm enthaltenen Dehydrogenasen zu rotem, wasserunlslichem Triphenylformazan (TPF) reduziert. Das TPF wird anschlieend mit Ethanol aus den Mikroorganismen
30、extrahiert und bei einer Wellenlnge von 485 nm photometrisch bestimmt. 5 Strungen 5.1 Allgemeines Belebtschlmme verschiedener Herkunft knnen unterschiedlich auf zu prfendes Testgut reagieren. Da die Inkubationszeit nur 1 h betrgt, muss bercksichtigt werden, dass eine Hemmwirkung, aber auch eine Akti
31、vierung ber eine lngere Zeitspanne, z. B. in einer kontinuierlich betriebenen Abwasserbehandlungs-anlage mit Belebtschlamm, ab- oder zunehmen kann. 5.2 Testgut, das Formazan entfrbt Die Matrix kann Stoffe enthalten, die auch ohne Dehydrogenaseaktivitt Formazan entfrben. Dies wird wie folgt geprft: 8
32、 ml Probe mit 1 ml TPF-Stammlsung (7.9) versetzen. Bei Entfrbung kann das Verfahren nicht angewendet werden. 5.3 Testgut mit Eigenfrbung Ist das Testgut stark gefrbt, knnen die Farbstoffe bei der Ethanolextraktion mit aufgenommen werden und anschlieend bei der photometrischen Auswertung zu berbefund
33、en fhren. In diesem Fall wird zustzlich ein Probenansatz ohne TTC-Lsung parallel bestimmt. Bei der Ergebnis-berechnung wird die ermittelte Extinktion ohne TTC-Zusatz von der ermittelten Extinktion mit TTC-Zusatz subtrahiert; dies ist im Analysenbericht anzugeben. Zustzlich muss die Eigenfrbung des B
34、elebtschlammes bercksichtigt werden. 7 B55EB1B3E14C22109E918E8EA43EDB30F09DCEB7EE8ED9NormCD - Stand 2010-10 DIN 38412-3:2010-10 5.4 Prfung des Testgutes mit reduzierenden Eigenschaften Stoffe mit reduzierenden Eigenschaften stren, indem TTC zu TPF reduziert wird. Bei der Prfung von Proben mit reduzi
35、erenden Eigenschaften frbt sich nach Zugabe der TTC-Lsung der Probenansatz sofort rot. Handelt es sich um Schwefelwasserstoff, die Proben etwa 15 min mit gereinigter Druckluft belften, um den Schwefelwasserstoff zu strippen. ANMERKUNG Liegen in den Proben leicht flchtige Komponenten vor, knnen diese
36、 mit ausgetragen werden und das Testergebnis verflschen. 5.5 Lipophile Stoffe Bei Belebtschlmmen und Testgut mit hohen Anteilen lipophiler Stoffe kann nach der Extraktion eine Trbung in der ethanolischen Phase auftreten und die photometrische Bestimmung stren. 6 Bezeichnung Bezeichnung des Verfahren
37、s Toxizittstest zur Bestimmung der Dehydrogenasenaktivittshemmung in Belebtschlamm (TTC-Test) (L 3): Verfahren DIN 38412 L 3 7 Reagenzien 7.1 Allgemeines Fr die Herstellung der Nhrmedien und Reagenzien nur Chemikalien des Reinheitsgrades zur Analyse“ verwenden. 7.2 Wasser, der Qualitt 1 nach DIN ISO
38、 3696 oder destilliertes bzw. deionisiertes Wasser mit einem DOC (en: Dissolved Organic Carbon, gelster organisch gebundener Kohlenstoff) 6,0 2,0 TS 2,0 bis 6,0 4,0 TS 100 mg/l bzw. korrespondierendem TOC-Gehalt den Kontrollansatz mit dem berstandswasser des Belebtschlamms ansetzen. Bei Proben mit e
39、inem CSB-Gehalt 100 mg/l bzw. korrespondierendem TOC-Gehalt den Kontrollansatz mit dem Verdnnungswasser nach 7.3 ansetzen. Das Testgut visuell auf Trbung, Frbung bzw. auf Feststoffgehalt prfen. Bei Trbung bzw. Frbung, siehe 5.3. Sind im Testgut Feststoffe enthalten, das Testgut mit Hilfe eines Dispe
40、rgiergert homogenisieren. Je nach Fragestellung kann die homogenisierte, abgesetzte oder filtrierte Probe eingesetzt werden. 11 B55EB1B3E14C22109E918E8EA43EDB30F09DCEB7EE8ED9NormCD - Stand 2010-10 DIN 38412-3:2010-10 Den pH-Wert der Probe messen und vor Testbeginn gegebenenfalls mit Salzsure (7.4) b
41、zw. Natrium-hydroxid-Lsung (7.5) auf einen pH-Wert von 7 bis 8 einstellen. Die Probe vor Testbeginn auf (20 2) C einstellen. Je nach Fragestellung drfen Proben mit Verdnnungswasser (7.3) verdnnt werden. 11.2 Testdurchfhrung Die Kontroll- und Testanstze werden als Doppelbestimmungen durchgefhrt. Dara
42、uf achten, dass die TTC-Lsung (7.11) immer zuletzt zugesetzt wird. Bei gefrbten Proben je Probe jeweils zwei Zentrifugenglser zustzlich bereithalten und weiter nach (5.3) verfahren. Den Belebtschlamm nach 8.2, Tabelle 1 in Zentrifugenglser pipettieren und 5 min bei 1 000 g zentrifugieren. Das bersta
43、ndswasser aller zentrifugierten Anstze dekantieren und in einem geeigneten Gef sammeln. In den Zentrifugenglsern fr die Anstze (A1) und (B) das zentrifugierte berstandswasser mit einem Gesamtvolumen von 8 ml belassen. Die Tests nach Tabelle 2 ansetzen. 12 B55EB1B3E14C22109E918E8EA43EDB30F09DCEB7EE8E
44、D9NormCD - Stand 2010-10 DIN 38412-3:2010-10 Tabelle 2 Ansatzreihe Ansatz Belebtschlamm zentrifugieren und dekantieren 8 ml berstands-wasser 8 ml Verdn-nungs-wasser (7.3) 0,2 ml Nhr-medium (7.6.1) 8 ml DCP-Lsung (7.6.3) 8 mlTest-gut 1 ml TTC-Lsung(7.11) A1 Kontrollansatz Probe 100 mg/l CSB bzw. korrespondierender TOC X X X A2 Kontrollansatz Probe 100 mg/l CSB bzw. korrespondierender TOC X X X B Nhrmedium- Referen
