1、Mai 2009DEUTSCHE NORM Normenausschuss Medizin (NAMed) im DINPreisgruppe 8DIN Deutsches Institut fr Normung e.V. Jede Art der Vervielfltigung, auch auszugsweise, nur mit Genehmigung des DIN Deutsches Institut fr Normung e.V., Berlin, gestattet.ICS 11.100.30!$Us“1508091www.din.deDDIN 58924Alleinverkau
2、f der Normen durch Beuth Verlag GmbH, 10772 Berlin www.beuth.deGesamtumfang 12 SeitenHmostaseologie Referenzmethode zur Bestimmung der Collagenbindungsaktivitt des VWF; Text Deutsch und Englisch Haemostaseology Reference method for the determination of the collagen binding acitvity of the VWF; Text
3、in German and English Hmostase Mthode de rfrence pour la dtermination de lactivit collagne binding du VWF; Texte en allemand et anglais B55EB1B3E14C22109E918E8EA43EDB30F09DCEB7EF8AD9NormCD - Stand 2010-04 DIN 58924:2009-05 2 Inhalt SeiteVorwort31 Anwendungsbereich.32 Normative Verweisungen.33 Begrif
4、fe.34 Abkrzungen .45 Bezeichnung56 Entnahme und Aufbereitung des Blutes57 Gerte, Materialien und Reagenzien 67.1 Gerte und Ausrstung67.2 Materialien und Reagenzien 68 Durchfhrung 88.1 Allgemeine Richtlinien .88.2 Bezugskurve88.3 Probenverdnnungen.88.4 Mindestanforderungen.98.5 Testablauf 98.6 Messun
5、g.108.7 Auswertung und Evaluierung der Daten .108.8 Ergebnisermittlung.109 Validierung des Testsystems 1010 Referenzintervall .1111 Strfaktoren des Testsystems 1112 Beeinflussung der Interpretation.11Literaturhinweise .12Contents PageForeword 31 Scope. 32 Normative references. 33 Terms and definitio
6、ns 34 Abbreviations 45 Designation. 56 Collection and processing of blood 57 Apparatus, materials and reagents. 67.1 Apparatus and equipment . 67.2 Materials and reagents 68 Procedure 88.1 General guidelines . 88.2 Reference curve 88.3 Sample dilutions. 88.4 Minimum requirements 98.5 Test sequence.
7、98.6 Measurement 108.7 Interpretation and evaluation of data 108.8 Report of results. 109 Validation of the test system. 1010 Reference interval 1111 Test system confounders 1112 Influences on interpretation 11Bibliography. 12B55EB1B3E14C22109E918E8EA43EDB30F09DCEB7EF8AD9NormCD - Stand 2010-04 DIN 5
8、8924:2009-05 3 Vorwort Diese Norm wurde vom NA 063-03-05 AA Hmostaseologie“ des Normenausschusses Medizin (NAMed) im DIN Deutsches Institut frNormung e. V. erarbeitet. Foreword This standard has been prepared by NA 063-03-05 AA “Hmostaseologie” (Haemosta-seology) of Normenausschuss Medizin (NAMed)(M
9、edical Standards Committee) in the DIN Deutsches Institut fr Normung e. V. (German Institute for Standardization). 1 Anwendungsbereich Diese Norm gilt fr die Bestimmung der funk-tionellen Collagenbindungsaktivitt des humanen von Willebrand Faktors in Citratplasma und von gereinigtem plasmatischen od
10、er rekombinanten von Willebrand Faktor in pharmazeutischen Prparaten.1 Scope This standard applies to the determination of the functional collagen binding activity of the human von Willebrand factor in citrated plasma and of purified plasmatic or recombinant von Willebrand factor in pharmaceutical p
11、reparations. 2 Normative Verweisungen Die folgenden zitierten Dokumente sind fr die Anwendung dieses Dokuments erforderlich. Bei datierten Verweisungen gilt nur die in Bezug genommene Ausgabe. Bei undatierten Verweisun-gen gilt die letzte Ausgabe des in Bezug genomme-nen Dokuments (einschlielich all
12、er nderungen). DIN 58905-1, Hmostaseologie Blutentnahme Teil 1: Gewinnung von vensem Citratplasma fr hmostaseologische Analysen DIN 58911-1, Hmostaseologie Kalibrierung von Messverfahren Teil 1: Gerinnungszeit-Messver-fahren DIN 58911-2, Hmostaseologie Kalibrierung von Messverfahren Teil 2: Photomet
13、rische Messver-fahren 2 Normative references The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies. DIN
14、58905-1, Haemostaseology Blood collection Part 1: Preparation of plasma from citrated venous blood for coagulation testing DIN 58911-1, Haemostaseology Calibration of measurement procedures Part 1: Clotting time measurement procedures DIN 58911-2, Haemostaseology Calibration of measurement procedure
15、s Part 2: Photometric measurement procedures 3 Begriffe Fr die Anwendung dieses Dokuments gelten die folgenden Begriffe. 3 Terms and definitions For the purposes of this document, the following terms and definitions apply. 3.1 von Willebrand Faktor Antigen humanes Glykoprotein groer Moleklmasse, das
16、 in der primren Hmostase sowohl fr die Interaktion zwischen Thrombozyt und Gefwand als auch von Thrombozyten untereinander verantwortlich ist, und in der sekundren Hmo-stase das Trgerprotein des F VIII ist und dessen Genort auf dem kurzen Arm des Chromosoms 12 liegt 3.1 von Willebrand factor antigen
17、 human glycoprotein of high molecular mass which, in primary haemostasis, is responsible for both the interaction between the thrombocytes and the vascular wall and the interaction of the thrombo-cytes among each other and, in secondary haemostasis, is the carrier protein of the F VIII, and whose ge
18、ne locus is on the short arm of chromo-some 12 B55EB1B3E14C22109E918E8EA43EDB30F09DCEB7EF8AD9NormCD - Stand 2010-04 DIN 58924:2009-05 4 3.2 von Willebrand Faktor Collagenbindungs-aktivitt Anteil des VWF, der an immoblisierte Collagene bindet 3.2 von Willebrand factor collagen binding activity VWF pr
19、oportion binding to immobilized collagens 4 Abkrzungen Folgende Abkrzungen werden in dieser Norm verwendet: BSA Rinderserum Albumin CBA Collagenbindungstest ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay HRP Meerrettich-Peroxidase OPD Phenylendiamin PBS Physiologischer Phosphatpuffer RSD Relative Standarda
20、bweichung, Varia-tionskoeffizient RT Raumtemperatur TMB 3,3, 5,5-Tetramethylbenzidin WHO World Health Organization Fr den von Willebrand Faktor gelten im Beson-deren die folgenden Definitionen: VWF von Willebrand Faktor VWS von Willebrand Syndrom VWF:Ag von Willebrand Faktor Antigen VWF:RCo von Will
21、ebrand Faktor Ristocetin-Cofaktor Aktivitt VWF:CB von Willebrand Faktor Collagen-bindungsaktivitt 4 Abbreviations For the purposes of this standard, the following abbreviations are used: BSA bovine serum albumin CBA collagen binding assay ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay HRP horseradish perox
22、idase OPD phenylenediamine PBS phosphate buffered saline RSD relative standard deviation, coefficient of variation RT room temperature TMB 3,3, 5,5-tetramethylbenzidine WHO World Health Organization Regarding the von Willebrand factor, the following definitions apply in particular: VWF von Willebran
23、d factor vWS von Willebrand syndrom VWF:Ag von Willebrand factor antigen VWF:RCo von Willebrand factor ristocetin cofactor activity VWF:CB von Willebrand factor collagen binding activity B55EB1B3E14C22109E918E8EA43EDB30F09DCEB7EF8AD9NormCD - Stand 2010-04 DIN 58924:2009-05 5 5 Bezeichnung Bezeichnun
24、g der Bestimmung der VWF:CB ist Bestimmung DIN 58924 VWF:CB 5 Designation The designation of the VWF:CB determination is Determination DIN 58924 VWF:CB 6 Entnahme und Aufbereitung des Blutes 6 Collection and processing of blood Die Entnahme und Aufbereitung des Blutes erfolgen nach DIN 58905-1. Bloo
25、d collection and processing are performed in accordance with DIN 58905-1. Im Gegensatz zu vielen anderen Gerinnungs-proteinen ist der VWF relativ stabil. Transport von Plasma oder Blut bei Raumtemperatur (RT) fhrt zu keinerlei Vernderungen, solange 48 h nicht ber-schritten werden. Danach kommt es zu
26、 einem graduellen Verlust groer Multimere und zu einem dysproportionalen Abfall funktioneller Teste wie VWF:RCo und VWF:CB, whrend das VWF:Ag ber noch lngere Zeit stabil bleibt 1. Hmo-lytische Proben knnen ein Hinweis auf fehlerhafte Blutentnahme und Lagerung sein und sind nicht zu verwenden. Die Tr
27、ansport- und Lagerungsbedin-gungen sind der Tabelle 1 zu entnehmen. In contrast to many other coagulation proteins, the VWF is relatively stable. The transport of plasma or blood at room temperature (RT) does not lead to any modifications, as long as a duration of 48 h is not exceeded. Afterwards a
28、gradual loss of large multimeres and a dysproportionate reduction in functional tests, such as VWF:RCo and VWF:CBassays, will occur while the VWF:Ag remains stable for a longer period of time 1. Haemolytic samples can be an indication of improper blood collection and storage and shall not be used. T
29、he transport and storage conditions shall be derived from Table 1. Tabelle 1/Table 1 Transport- und Lagerungsbedingungen/Transport and storage conditions Probea/SampleaTemperatur/Temperature Zeit/Time Citratblut/Citrated blood Raumtemperatur/Room temperature 48 h Citratplasma/Citrated plasma Raumtem
30、peratur/Room temperature 48 h Citratplasma/Citrated plasma 20 Cb 12 Monate/ 12 Months Citratplasma/Citrated plasma 70 Cb 24 Monate/ 24 Months a Lagerung und Transport bei Khlschranktemperatur ist nicht geeignet, da dies zu qualitativen Vernderungen fhrt (Vortuschung von VWS Typ 2)./Storage and trans
31、port at refrigerator temperature are unsuitable as they result in qualitative changes (pseudo-type 2 VWF). b Der Auftauvorgang sollte bei 37 C ohne Zentrifugation durchgefhrt werden./Thawing should be performed at 37 C without centrifugation. B55EB1B3E14C22109E918E8EA43EDB30F09DCEB7EF8AD9NormCD - St
32、and 2010-04 DIN 58924:2009-05 6 7 Apparatus, materials and reagents 7.1 Gerte und Ausrstung ELISA-Plattenlesegert (ELISA reader); Gertespezifische Zusatzausrstung wie PC und Auswertesoftware; kalibrierte Pipetten und Mehrkanalpipetten; ELISA-Plattenwaschger t (das manuelle Wa-schen von ELISA-Platten
33、 ist zu vermeiden); Trockenschrank fr die Inkubation von ELISA-Platten. 7.1 Apparatus and equipment ELISA reader; apparatus-specific additional equipment such as PC and evaluation software; calibrated pipettes and multichannel pipettes; ELISA plate washer (manual washing of ELISA plates shall be avo
34、ided); drying oven for the incubation of ELISA plates.7.2 Materialien und Reagenzien 7.2 Materials and reagents 7.2.1 ELISA-Platten Als ELISA-Platten stehen Platten mit 96 Vertie-fungen (96 well) zur Verfgung, die eine Beschich-tung aufgrund physikalischer Adsorption erlauben und vorzugsweise aus Po
35、lystyrol hergestellt sind. Es sind Plattentypen mit hoher Proteinbindungs-kapazitt zu bevorzugen. Alternativ dazu ist auch die kovalente Immobilisierung von Typ III Collagen aus humaner Plazenta an praktivierte ELISA-Platten ber einen Spacer-Arm beschrieben 2. Bei Verwendung einer neuen Charge von P
36、latten ist es empfehlenswert, die Eignung in Kombination mit dem jeweiligen Collagen zu testen. Darber hinaus ist exemplarisch die Homogenitt der Beschichtung in Sonderheit in den Randbereichen der Platte nachzuweisen. 7.2.1 ELISA plates The available ELISA plates are plates with 96 wells, where coa
37、ting is possible as a result of physical adsorption and which are preferably made of polystyrol. Plate types having a high protein binding capacity shall be given preference. Alternatively, the covalent immobilization of type III collagen from human placentas onto pre-activated ELISA plates via a sp
38、acer arm is described 2. When using a new batch of plates, it is to be recommended to test their suitability in combination with the relevant collagen. In addition, the coating homogeneity, particularly that in the boundary areas of the plates, shall be demonstrated exemplarily. 7.2.2 Collagen Als g
39、eeignete Collagene haben sich kommerziell erhltliche Prparationen der Typen I (z. B. fibrillres Collagen aus der Pferdesehne) oder Typ III (z. B. Collagen aus humaner Plazenta) erwiesen 3. Da diese im Handel erhltlichen Collagene normalerweise nicht speziell fr die Durchfhrung des Collagenbindungste
40、sts herge-stellt werden, ist jede Charge in Vorversuchen auf ihre Eignung zu prfen. Typische Beschichtungs-konzentrationen sind fr Typ I Collagen (fibrillr, Pferdesehne) (10 bis 50) g/ml, fr Typ III Collagen (humane Plazenta) (1 bis 5) g/ml. 7.2.2 Collagen Commercially available preparations of type
41、 I (e.g. fibrillar collagen from horse tendons) or type III(e.g. collagen from human placentas) have proven to be suitable collagens 3. Since, normally, these commercially available collagens are not specially made for performing the collagen binding assay, each batch shall be tested for suitability
42、 in pre-tests. Typical coating concentrations are (10 to 50) g/ml for type I collagen (fibrillar, horse tendon) and (1 to 5) g/ml for type III collagen (human placenta).7 Gerte, Materialien und Reagenzien B55EB1B3E14C22109E918E8EA43EDB30F09DCEB7EF8AD9NormCD - Stand 2010-04 DIN 58924:2009-05 7 7.2.3
43、Antikrper Hoch spezifische polyklonale anti-VWF Antikrper (beispielsweise aus dem Kaninchen) sind kommer-ziell erhltlich und knnen als Enzymkonjugate (z. B. als Peroxidase-Konjugat) verwendet werden.7.2.3 Antibodies Highly specific polyclonal anti-VWF antibodies (for example from rabbits) are commer
44、cially available and can be used as enzymatic conjugates (e.g. as peroxidase conjugate). 7.2.4 Puffersysteme Beschichtungslsungen: Fibrillre Collagene sind in der Regel nur im sauren Milieu lslich, fr die Beschichtung sind daher saure Lsungen (pH 4) zu empfehlen. Darber hinaus knnen auch hochionisch
45、e Lsungen unter Zusatz von stabilisierenden Kohlenhydraten ver-wendet werden. Die Beschichtung mit Typ-III-Collagenen kann gegebenenfalls auch bei neut-ralen pH-Werten, beispielsweise in PBS-Puffer, pH 7,3, durchgefhrt werden. 7.2.4 Buffer systems Coating solutions: As a rule, fibrillar collagens ar
46、e soluble in an acidic environment only; therefore, acidic solutions (pH value 4) are to be recommended for the coating. Furthermore, highly ionic solutions can be used to which stabilizing carbohydrates have been added. If applicable, coating with type III collagens can also be carried out at neutral pH values, for example in a PBS buffer w
