1、Juni 2013 Normenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL) im DINPreisgruppe 15DIN Deutsches Institut fr Normung e. V. Jede Art der Vervielfltigung, auch auszugsweise, nur mit Genehmigung des DIN Deutsches Institut fr Normung e. V., Berlin, gestattet.ICS 67.050Zur Erstellung einer
2、 DIN SPEC knnen verschiedene Verfahrensweisen herangezogen werden: Das vorliegende Dokument wurde nach den Verfahrensregeln einer Vornorm erstellt.!$r“1799057www.din.deDDIN CEN/TS 15633-2Lebensmittel Nachweis von Lebensmittelallergenen mit immunologischen Verfahren Teil 2: Quantitative Bestimmung vo
3、n Haselnuss mit einemEnzym-Immunoassayverfahren unter Verwendung von monoklonalenAntikrpern und Proteindetektion mit Bicinchoninsure;Deutsche Fassung CEN/TS 15633-2:2013Foodstuffs Detection of food allergens by immunological methods Part 2: Quantitative determination of hazelnut with an enzyme immun
4、oassay usingmonoclonal antibodies and bicinchoninic acid-protein detection;German version CEN/TS 15633-2:2013Produits alimentaires Dtection des allergnes alimentaires par mthodes immunologiques Partie 2: Dtermination quantitative de la prsence de noisette par un immuno-essaienzymatique laide dantico
5、rps monoclonaux et dtection des protines avec lacidebicinchoninique;Version allemande CEN/TS 15633-2:2013Alleinverkauf der Spezifikationen durch Beuth Verlag GmbH, 10772 Berlin www.beuth.deGesamtumfang 34 SeitenDIN SPEC 10700-1DIN CEN/TS 15633-2 (DIN SPEC 10700-1):2013-06 2 Nationales Vorwort Dieses
6、 Dokument (CEN/TS 15633-2:2013) wurde vom Technischen Komitee CEN/TC 275 Lebensmittel-analytik Horizontale Verfahren“ erarbeitet, dessen Sekretariat vom DIN (Deutschland) gehalten wird. Das zustndige deutsche Normungsgremium ist der Arbeitsausschuss NA 057-01-05 AA Lebensmittelallergene“ des Normena
7、usschusses Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL) im DIN e. V. Eine DIN SPEC nach dem Vornorm-Verfahren ist das Ergebnis einer Normungsarbeit, das wegen bestimmter Vorbehalte zum Inhalt oder wegen des gegenber einer Norm abweichenden Aufstellungsverfahrens vom DIN noch nicht als Norm he
8、rausgegeben wird. Zur vorliegenden DIN SPEC wurde kein Entwurf verffentlicht. Erfahrungen mit dieser DIN SPEC sind erbeten vorzugsweise als Datei per E-Mail an naldin.de in Form einer Tabelle. Die Vorlage dieser Tabelle kann im Internet unter http:/www.din.de/stellungnahme abgerufen werden; oder in
9、Papierform an den Normenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL) im DIN Deutsches Institut fr Normung e. V., Burggrafenstrae 6, 10787 Berlin. TECHNISCHE SPEZIFIKATION TECHNICAL SPECIFICATION SPCIFICATION TECHNIQUE CEN/TS 15633-2 April 2013 ICS 67.050 Deutsche Fassung Lebensmitte
10、l Nachweis von Lebensmittelallergenen mit immunologischen Verfahren Teil 2: Quantitative Bestimmung von Haselnuss mit einem Enzym-Immunoassayverfahren unter Verwendung von monoklonalen Antikrpern und Proteindetektion mit Bicinchoninsure Foodstuffs Detection of food allergens by immunological methods
11、 Part 2: Quantitative determination of hazelnut with an enzyme immunoassay using monoclonal antibodies and bicinchoninic acid-protein detection Produits alimentaires Dtection des allergnes alimentaires par des mthodes danalyse immunologiques Partie 2: Dtermination quantitative de la prsence de noise
12、tte par un immuno-essai enzymatique laide danticorps monoclonaux et dtection des protines avec lacide bicinchoninique Diese Technische Spezifikation (CEN/TS) wurde vom CEN am 7. Januar 2013 als eine knftige Norm zur vorlufigen Anwendung angenommen. Die Gltigkeitsdauer dieser CEN/TS ist zunchst auf d
13、rei Jahre begrenzt. Nach zwei Jahren werden die Mitglieder des CEN gebeten, ihre Stellungnahmen abzugeben, insbesondere ber die Frage, ob die CEN/TS in eine Europische Norm umgewandelt werden kann. Die CEN-Mitglieder sind verpflichtet, das Vorhandensein dieser CEN/TS in der gleichen Weise wie bei ei
14、ner EN anzukndigen und die CEN/TS verfgbar zu machen. Es ist zulssig, entgegenstehende nationale Normen bis zur Entscheidung ber eine mgliche Umwandlung der CEN/TS in eine EN (parallel zur CEN/TS) beizubehalten. CEN-Mitglieder sind die nationalen Normungsinstitute von Belgien, Bulgarien, Dnemark, De
15、utschland, der ehemaligen jugoslawischen Republik Mazedonien, Estland, Finnland, Frankreich, Griechenland, Irland, Island, Italien, Kroatien, Lettland, Litauen, Luxemburg, Malta, den Niederlanden, Norwegen, sterreich, Polen, Portugal, Rumnien, Schweden, der Schweiz, der Slowakei, Slowenien, Spanien,
16、 der Tschechischen Republik, der Trkei, Ungarn, dem Vereinigten Knigreich und Zypern. EUROPISCHES KOMITEE FR NORMUNG EUROPEAN COMMITTEE FOR STANDARDIZATION COMIT EUROPEN DE NORMALISATION Management-Zentrum: Avenue Marnix 17, B-1000 Brssel 2013 CEN Alle Rechte der Verwertung, gleich in welcher Form u
17、nd in welchem Verfahren, sind weltweit den nationalen Mitgliedern von CEN vorbehalten. Ref. Nr. CEN/TS 15633-2:2013 D CEN/TS 15633-2:2013 (D) 2 Inhalt Seite Vorwort 3 Einleitung 4 1 Anwendungsbereich 5 2 Kurzbeschreibung 5 3 Reagenzien . 6 4 Gerte und Ausrstungen . 6 5 Durchfhrung . 7 6 Bewertung 12
18、 Anhang A (informativ) Interne Validierung (betriebsinterne Untersuchung des Herstellers) 14 A.1 Przision (Varianz innerhalb einer Untersuchung und zwischen Untersuchungen). 14 A.2 Sensitivitt 15 A.3 Genauigkeit/Richtigkeit 19 A.4 Spezifitt/Selektivitt (Strungen) . 22 A.5 Robustheit des Verfahrens (
19、Unempfindlichkeit) . 25 A.6 Kalibrierkurve . 27 A.7 Stabilittsprfung/-daten . 27 Anhang B (informativ) Ringversuch . 30 Literaturhinweise 32 DIN CEN/TS 15633-2 (DIN SPEC 10700-1):2013-06 CEN/TS 15633-2:2013 (D) 3 Vorwort Dieses Dokument (CEN/TS 15633-2:2013) wurde vom Technischen Komitee CEN/TC 275
20、Lebensmittelanalytik Horizontale Verfahren“ erarbeitet, dessen Sekretariat vom DIN gehalten wird. Es wird auf die Mglichkeit hingewiesen, dass einige Texte dieses Dokuments Patentrechte berhren knnen. CEN und/oder CENELEC sind nicht dafr verantwortlich, einige oder alle diesbezglichen Patentrechte z
21、u identifizieren. Zu dieser Technischen Spezifikation bestehen die folgenden Teile: EN 15633-1, Lebensmittel Nachweis von Lebensmittelallergenen mit immonologischen Verfahren Teil 1: Allgemeine Betrachtungen CEN/TS 15633-2, Lebensmittel Nachweis von Lebensmittelallergenen mit immonologischen Verfahr
22、en Teil 2: Quantitative Bestimmung von Haselnuss mit einem Enzym-Immunoassayverfahren unter Verwendung von monoklonalen Antikrpern und Proteindetektion mit Bicinchoninsure CEN/TS 15633-3, Lebenmittel Nachweis von Lebensmittelallergenen mit immonologischen Verfahren Teil 3: Quantitative Bestimmung vo
23、n Haselnuss mit einem Enzym-Immunoassayverfahren unter Verwendung von polyklonalen Antikrpern und Proteindetektion nach Lowry Entsprechend der CEN/CENELEC-Geschftsordnung sind die nationalen Normungsinstitute der folgenden Lnder gehalten, diese Technische Spezifikation anzukndigen: Belgien, Bulgarie
24、n, Dnemark, Deutschland, Estland, Finnland, Frankreich, Griechenland, Irland, Island, Italien, Kroatien, Lettland, Litauen, Luxemburg, Malta, die ehemalige jugoslawische Republik Mazedonien, Niederlande, Norwegen, sterreich, Polen, Portugal, Rumnien, Schweden, Schweiz, Slowakei, Slowenien, Spanien,
25、Tschechische Republik, Trkei, Ungarn, Vereinigtes Knigreich und Zypern. DIN CEN/TS 15633-2 (DIN SPEC 10700-1):2013-06 CEN/TS 15633-2:2013 (D) 4 Einleitung Haselnsse (Corylus avellana) haben eine weit verbreitete Anwendung in der Lebensmittelindustrie, besonders in der Schokoladen- und Nougatprodukti
26、on. In diesen Fllen bestimmt die Haselnussmenge die Qualitt eines Produktes. Haselnsse werden ebenfalls hufig in Swaren, Backwaren, Keksen, Frhstcks-zerealien und Eiscremes verwendet. Bedauerlicherweise sind Haselnsse eine der Hauptursachen fr Lebensmittelallergien. Die Haselnussmenge, die zu einer
27、allergischen Reaktion fhrt, hngt von der Sensibilitt der Einzelperson ab. Sogar der Verzehr weniger Milligramm Haselnuss kann bei hochgradig sensiblen Einzelpersonen allergische Reaktionen hervorrufen. Mengen, angefangen von 0,7 mg/kg bis zu 100 mg/kg knnen Reaktionen bei sensibilisierten Einzelpers
28、onen verursachen 1. Symptome einer allergischen Reaktion knnen rtlichen Juckreiz des Mund- und Rachenbereichs bis zu einer schweren, lebensbedrohlichen Anaphylaxie (Schockzustand) einschlieen. Besonders gefhrlich sind bewusst zugefgte Haselnsse in Lebensmitteln, die nicht deklariert sind. Auch Spure
29、n von Haselnssen oder Nougat, als Ergebnis der Kreuz-Kontaminationen sind ein Gesundheitsrisiko. Die Allergie wird neben anderen Proteinen durch Glycoproteine verursacht, wie z. B. Corylin, ein in der Haselnuss enthaltenes Speicherprotein mit einem Molekulargewicht von 18 kDa, das dem Cor a1-Antigen
30、 von Haselnusspollen hnlich und dem Bet v1-Antigen von Birkenpollen homolog ist. Corylin gehrt, neben Cor a8, Cor a9 und Cor a11, als typische Beispiele fr Samen-Speicherproteine und Lipid-Transfer-Proteine (LTP-Proteine), zu den allergenen Hauptproteinen. Corylin wird zwischen der mit Pollen verbun
31、denen Allergie und der nicht mit Pollen verbundenen Allergie unterschieden. DIN CEN/TS 15633-2 (DIN SPEC 10700-1):2013-06 CEN/TS 15633-2:2013 (D) 5 1 Anwendungsbereich Diese Technische Spezifikation legt ein ELISA-Verfahren (enzymgebundenes Immunosorbent-Verfahren, en: enzyme linked immunosorbent as
32、say) fr den Nachweis von Haselnuss aus Lebensmittelproben fest. Im ELISA-Verfahren binden die Antikrper an die Haselnussproteine aus den Lebensmittelproben. Das Ergebnis aus dem ELISA-Verfahren wird in mg Haselnuss/kg (ppm) angegeben, da die Kalibratoren aus einem Extrakt der ganzen Haselnuss besteh
33、en. Matrices wie Zerealien, Eiscreme, Kekse, Schokolade, Wrstchen, Httenkse, Joghurt und Salatdressing wurden durch Aufstockversuche mit einer Haselnusspaste enthaltenden Carboxymethylcellulose-Suspension 2 validiert. Die monoklonalen Antikrper, die gegen den gesamten wssrigen Haselnussextrakt geric
34、htet sind, weisen sowohl Proteine mit ungefhren Molekulargewichten von 14 kDa, 18 kDa und 42 kDa als auch das thermostabile Major-Allergen Cor a9 (11S-Speicherprotein) nach. Beide Antikrper wurden durch den Western Blot, mit teilweise gereinigten Haselnussextrakten und gereinigten allergenen Protein
35、en, bewertet. Das ELISA-Prfverfahren ist kommerziell erhltlich1). Die Leistungsfhigkeit wurde in einer vom Hersteller durchgefhrten betriebsinternen Validierung besttigt. Alle interessierenden Parameter sind angegeben. Zustzlich wurde das ELISA-Verfahren durch einen Ringversuch erfolgreich validiert
36、, um die Vergleich-przision zwischen den Laboratorien zu bestimmen. Dieser Ringversuch, an dem 14 deutsche Laboratorien beteiligt waren, wurde durch die beim Bundesamt fr Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (BVL) bestehende Arbeitsgruppe zur Durchfhrung von 64 des Lebensmittel-, Bedarfsgege
37、nstnde- und Futter-mittelgesetzbuches (LFGB) fr die Bestimmung des Haselnussgehalts in feinherber Schokolade organisiert. 2 Kurzbeschreibung Ein direktes Sandwich-Enzymimmunoassay (ELISA) wird fr den Nachweis von Haselnuss verwendet. Die Grundlage ist eine Antigen-Antikrper-Reaktion. Zwei haselnuss-
38、spezifische monoklonale Antikrper werden fr die Bestimmung des Analyten verwendet. Die Antikrper erkennen das haselnuss-spezifische Protein Cor a9. Eine Mikrotiterplatte wird mit den monoklonalen gekoppelten Antikrpern Maus-Anti-Cor a9-Antikrper beschichtet. Die mit dem Test Kit bereitgestellten Has
39、elnuss-Standards oder die Probenextrakte werden fr die Dauer von 10 min inkubiert. Nach dem Waschen wird ein mit Peroxidase markierter monoklonaler Nachweis-Antikrper Maus-Anti-Cor a9-Antikrper als das Enzym-Konjugat fr weitere 10 min hinzugefgt. Das Konjugat bindet sich an den Haselnuss-Protein-Ant
40、ikrperkomplex auf der Platte. Anschlieend wird jegliches ungebundene Enzym-Konjugat durch einen Waschschritt entfernt. Chromogen/Substrat wird zu den Kavitten hinzugefgt und fr die Dauer von 10 min inkubiert. Das gebundene Enzym wandelt das Chromogen in ein blau gefrbtes Produkt um. Die Zugabe eines
41、 Stoppreagens hemmt den enzymatischen Prozess und bewirkt einen Farbumschlag des gefrbten Produktes nach Gelb. Die Messung der Extinktion wird bei 450 nm gegen Luft durchgefhrt. Die sich ergebenden Extinktionswerte sind proportional der Konzentration von Haselnuss in einer Probe. Das Ergebnis wird a
42、ls Haselnuss in mg/kg angegeben. Als Standard-Stammlsung fr weitere Verdnnungen wurde ein wssriger Haselnussextrakt von sechs verschiedenen Haselnussarten (Hallesche Riesen, Levantiner, Kerassunder, Piemonteser, Runde Rmer, Barcelona Giants) verwendet. Diese sechs Arten, roh und gerstet, sind reprse
43、ntativ fr die Haselnsse, die weltweit von der Lebensmittel-Industrie in Lebensmittel-Produkten verwendet werden. Die Standard-Stammlsung wird schrittweise weiter verdnnt (siehe 3.1.2). Der Extrakt der verschiedenen Haselnsse hat einen Proteingehalt von etwa 9 % Protein, der mit dem photometrischen B
44、estimmungsverfahren fr Protein entsprechend dem BCA-Protein-Test (Test mit Bicinchoninsure) (Pierce) ermittelt wurde. 1) RIDASCREENFAST Hazelnut ist die Herstellerbezeichnung des Produktes, geliefert von R-Biopharm AG, Darmstadt, Deutschland. Diese Angabe dient zur Unterrichtung der Anwender dieser
45、Technischen Spezifikation und bedeutet keine Anerkennung dieses Produktes durch CEN-CENELEC. Gleichwertige Produkte drfen verwendet werden, wenn sie nachweisbar zu gleichen Ergebnissen fhren. DIN CEN/TS 15633-2 (DIN SPEC 10700-1):2013-06 CEN/TS 15633-2:2013 (D) 6 3 Reagenzien Der Test kann in einer
46、Standard-Laborumgebung durchgefhrt werden. Das Test Kit muss gekhlt (4 C bis 8 C) gelagert werden. 3.1 Gewhnlich mit dem Test Kit gelieferte Reagenzien Alle Substanzen, die fr die Herstellung der Komponenten und Puffer verwendet werden, mssen analytischen Reinheitsgrad besitzen. 3.1.1 Mikrotiterplat
47、te, 48 Kavitten (6 Streifen mit jeweils 8 Kavitten), beschichtet mit dem monoklonalen Antikrper Anti-Cor a9. 3.1.2 Standards, je 1,3 ml, mit 0 mg/kg (Nullstandard), 2,5 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg und 20 mg/kg Haselnuss in wssriger Lsung; gebrauchsfertig. (Diese Konzentrationen entsprechen den tatschli
48、chen Haselnussmengen von 0 ng/ml, 125 ng/ml, 250 ng/ml, 500 ng/ml und 1 000 ng/ml Haselnuss in den Flschchen.) 3.1.3 Konjugat, 11-fach konzentrierte wssrige Lsung von mit Meerrettich-Peroxidase markierten monoklonalen Nachweis-Antikrpern Anti-Cor a9. Die erforderliche Menge wurde durch Titration bes
49、timmt. Der Konjugatpuffer besteht aus 10 mmol/l Phosphatpuffer 1 + 1 mit Stabilzyme2)gemischt, dieser enthlt schlielich 150 mmol/l Salz, 5 % Sorbitol, 2 % BSA (Rinderserumalbumin), 0,1 % Kathon2), Tartrazin/Patentblau als Farbstoff. 3.1.4 Chromogen/Substrat, gefrbt, gebrauchsfertiges Tetramethylbenzidin (TMB)/Harnstoffperoxidlsung (z. B. von
