1、Oktober 2012 Normenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL) im DINPreisgruppe 16DIN Deutsches Institut fr Normung e. V. Jede Art der Vervielfltigung, auch auszugsweise, nur mit Genehmigung des DIN Deutsches Institut fr Normung e. V., Berlin, gestattet.ICS 67.050Zur Erstellung ei
2、ner DIN SPEC knnen verschiedene Verfahrensweisen herangezogen werden: Das vorliegende Dokument wurde nach den Verfahrensregeln einer Vornorm erstellt.!$tf“1819067www.din.deDDIN CEN/TS 15633-3Lebensmittel Nachweis von Lebensmittelallergenen mit immunologischen Verfahren Teil 3: Quantitative Bestimmun
3、g von Haselnuss mit einemEnzym-Immunoassayverfahren unter Verwendung von polyklonalenAntikrpern und Proteindetektion nach Lowry;Deutsche Fassung CEN/TS 15633-3:2012Foodstuffs Detection of food allergens by immunological methods Part 3: Quantitative determination of hazelnut with an enzyme immunoassa
4、y usingpolyclonal antibodies and Lowry protein detection;German version CEN/TS 15633-3:2012Alleinverkauf der Spezifikationen durch Beuth Verlag GmbH, 10772 Berlin www.beuth.deGesamtumfang 37 SeitenDIN SPEC 10700-2Produits alimentaires Dtection des allergnes alimentaires par des mthodes danalyse immu
5、nologiques Partie 3: Dtermination quantitative de la prsence de noisette par un immunoessai enzymatique laide danticorps polyclonaux et dtection des protines par la mthode de Lowry; Version allemande CEN/TS 156333:2012 a DIN CEN/TS 15633-3 (DIN SPEC 10700-2):2012-10 2 Nationales Vorwort Dieses Dokum
6、ent (CEN/TS 15633-3:2012) wurde vom Technischen Komitee CEN/TC 275 Lebensmittel-analytik Horizontale Verfahren“ erarbeitet, dessen Sekretariat vom DIN (Deutschland) gehalten wird. Das zustndige deutsche Normungsgremium ist der Arbeitsausschuss NA 057-01-05 AA Lebensmittelallergene“ des Normenausschu
7、sses Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL) im DIN e. V. Eine DIN SPEC nach dem Vornorm-Verfahren ist das Ergebnis einer Normungsarbeit, das wegen bestimmter Vorbehalte zum Inhalt oder wegen des gegenber einer Norm abweichenden Aufstellungsverfahrens vom DIN noch nicht als Norm herausge
8、geben wird. Zur vorliegenden DIN SPEC wurde kein Entwurf verffentlicht. Erfahrungen mit dieser DIN SPEC sind erbeten vorzugsweise als Datei per E-Mail an naldin.de in Form einer Tabelle. Die Vorlage dieser Tabelle kann im Internet unter http:/www.din.de/stellungnahme abgerufen werden; oder in Papier
9、form an den Normenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL) im DIN Deutsches Institut fr Normung e. V., Burggrafenstrae 6, 10787 Berlin. TECHNISCHE SPEZIFIKATION TECHNICAL SPECIFICATION SPCIFICATION TECHNIQUE CEN/TS 15633-3 August 2012 ICS 67.050 Deutsche Fassung Lebensmittel - N
10、achweis von Lebensmittelallergenen mit immunologischen Verfahren - Teil 3: Quantitative Bestimmung von Haselnuss mit einem Enzym-Immunoassayverfahren unter Verwendung von polyklonalen Antikrpern und Proteindetektion nach Lowry Foodstuffs - Detection of food allergens by immunological methods - Part
11、3: Quantitative determination of hazelnut with an enzyme immunoassay using polyclonal antibodies and Lowry protein detection Diese Technische spezifikation (CEN/TS) wurde vom CEN am 4. Mrz 2012 als eine knftige Norm zur vorlufigen Anwendung angenommen. Die Gltigkeitsdauer dieser CEN/TS ist zunchst a
12、uf drei Jahre begrenzt. Nach zwei Jahren werden die Mitglieder des CEN gebeten, ihre Stellungnahmen abzugeben, insbesondere ber die Frage, ob die CEN/TS in eine Europische Norm umgewandelt werden kann. Die CEN Mitglieder sind verpflichtet, das Vorhandensein dieser CEN/TS in der gleichen Weise wie be
13、i einer EN anzukndigen und die CEN/TS verfgbar zu machen. Es ist zulssig, entgegenstehende nationale Normen bis zur Entscheidung ber eine mgliche Umwandlung der CEN/TS in eine EN (parallel zur CEN/TS) beizubehalten. CEN-Mitglieder sind die nationalen Normungsinstitute von Belgien, Bulgarien, Dnemark
14、, Deutschland, der ehemaligen jugoslawischen Republik Mazedonien, Estland, Finnland, Frankreich, Griechenland, Irland, Island, Italien, Kroatien, Lettland, Litauen, Luxemburg, Malta, den Niederlanden, Norwegen, sterreich, Polen, Portugal, Rumnien, Schweden, der Schweiz, der Slowakei, Slowenien, Span
15、ien, der Tschechischen Republik, der Trkei, Ungarn, dem Vereinigten Knigreich und Zypern. Management-Zentrum: Avenue Marnix 17, B-1000 Brssel 2012 CEN Alle Rechte der Verwertung, gleich in welcher Form und in welchem Verfahren, sind weltweit den nationalen Mitgliedern von CEN vorbehalten. Ref. Nr. C
16、EN/TS 15633-3:2012 D E U ROP I S C H E SKOM I T E EF RNOR M U NGEUROPEAN COMMITTEE FOR STANDARDIZATION CO M I T E U RO P E N DE N O R M A L I S AT I ONProduits alimentaires - Dtection des allergnes alimentaires par des mthodes danalyse immunologiques - Partie 3: Dtermination quantitative de la prsen
17、ce de noisette par un immunoessai enzymatique laide danticorps polyclonaux et dtection des protines par la mthode de Lowry; Version allemande CEN/TS 156333:2012 CEN/TS 15633-3:2012 (D) 2 Inhalt Seite Vorwort 3 Einleitung .4 1 Anwendungsbereich .5 2 Normative Verweisungen 5 3 Begriffe .5 4 Kurzbeschr
18、eibung .5 5 Reagenzien .6 5.1 Gewhnlich mit dem Test Kit gelieferte Reagenzien: 6 5.2 Herstellung von Lsungen mit der Arbeitskonzentration aus Konzentraten 7 5.3 Nicht mit dem Test Kit gelieferte Reagenzien .7 6 Gerte und Ausrstungen 8 7 Allgemeine Anleitungen/Empfehlungen/Vorbereitung 9 7.1 Allgeme
19、ines 9 7.2 Vorbereitung der Probe .9 7.2.1 Probenart und -umfang, einschlielich Identifizierung der Probe .9 7.2.2 Probenahme, Transport, Konservierung und Lagerung 9 7.2.3 Vorbereitung der Untersuchungsprobe 9 7.3 Durchfhrung des Immunoassays/Ablaufplan .10 7.3.1 Allgemeines 10 7.3.2 Untersuchungss
20、chritte .11 7.3.3 Physikalische Bedingungen/Umgebungsbedingungen 11 7.3.4 Kalibrierung der Gerte .11 7.3.5 Vermeidung von Verschmutzung/Entsorgung von Abfllen 11 7.4 Ablesung/Beurteilung und Untersuchungsbericht (Berechnungen, Berichterstattung) .11 7.4.1 Allgemeines 11 7.4.2 Mathematische Modelle 1
21、2 7.4.3 Umrechnung von Ergebnissen in Haselnussmasse 14 8 Schtzung der Messunsicherheit .14 Anhang A (informativ) Validierungsstatus und Leistungskriterien/Leistungsverhalten des Verfahrens 15 A.1 Allgemeines 15 A.2 Interne Validierung (betriebsinterne Untersuchung des Herstellers) 16 A.2.1 Przision
22、 (Streuung innerhalb einer Untersuchung und zwischen Untersuchungen) .16 A.2.2 Sensitivitt 17 A.2.3 Genauigkeit/Richtigkeit .20 A.2.4 Spezifitt/Selektivitt (Strungen) .21 A.2.5 Robustheit des Verfahrens (Unempfindlichkeit) 23 A.2.6 Kalibrierkurve .29 A.2.7 Stabilittsprfung/Daten .31 A.3 Ringversuch
23、.33 Literaturhinweise 35 DIN CEN/TS 15633-3 (DIN SPEC 10700-2):2012-10 CEN/TS 15633-3:2012 (D) 3 Vorwort Dieses Dokument (CEN/TS 15633-3:2012) wurde vom Technischen Komitee CEN/TC 275 Lebensmittel-analytik Horizontale Verfahren“ erarbeitet, dessen Sekretariat vom DIN gehalten wird. Es wird auf die M
24、glichkeit hingewiesen, dass einige Texte dieses Dokuments Patentrechte berhren knnen. CEN und/oder CENELEC sind nicht dafr verantwortlich, einige oder alle diesbezglichen Patentrechte zu identifizieren. Zu dieser Technischen Spezifikation bestehen die folgenden Teile: EN 15633-1, Lebensmittel Nachwe
25、is von Lebensmittelallergenen mit immunologischen Verfahren Teil 1: Allgemeine Betrachtungen FprCEN/TS 15633-2, Lebensmittel Nachweis von Lebensmittelallergenen mit immunologischen Verfahren Teil 2: Quantitative Bestimmung von Haselnuss mit einem Enzym-Immunoassayverfahren unter Verwendung von monok
26、lonalen Antikrpern und Proteindetektion mit Bicinchoninsure CEN/TS 15633-3, Lebensmittel Nachweis von Lebensmittelallergenen mit immunologischen Verfahren Teil 3: Quantitative Bestimmung von Haselnuss mit einem Enzym-Immunoassayverfahren unter Verwendung von polyklonalen Antikrpern und Proteindetekt
27、ion nach Lowry Entsprechend der CEN/CENELEC-Geschftsordnung sind die nationalen Normungsinstitute der folgenden Lnder gehalten, diese Technische Spezifikation anzukndigen: Belgien, Bulgarien, Dnemark, Deutschland, Estland, Finnland, Frankreich, Griechenland, Irland, Island, Italien, Kroatien, Lettla
28、nd, Litauen, Luxemburg, Malta, die ehemalige jugoslawische Republik Mazedonien, Niederlande, Norwegen, sterreich, Polen, Portugal, Rumnien, Schweden, Schweiz, Slowakei, Slowenien, Spanien, Tschechische Republik, Trkei, Ungarn, Vereinigtes Knigreich und Zypern. DIN CEN/TS 15633-3 (DIN SPEC 10700-2):2
29、012-10 CEN/TS 15633-3:2012 (D) 4 Einleitung Die Haselnuss (Corylus avellana) gehrt zu einer Gruppe von Lebensmitteln, die im Allgemeinen als Baum-nsse bezeichnet werden. Allergische Reaktionen auf Haselnuss, die vom oralen Allergiesyndrom bis zur schweren Anaphylaxie reichen, wurden ausfhrlich in Be
30、richten dargelegt. Nach der Gesetzgebung zur Lebensmittelkennzeichnung ist in einer Vielzahl von Nationen der Europischen Union, Nordamerikas, Asiens und Australasiens eine Angabe zum Vorliegen von Haselnuss in Lebensmitteln erforderlich. Untersuchungen zur IgE-Bindung am Serum von sensibilisierten
31、Patienten haben eine Reihe von Allergenen aufgedeckt, einschlielich sowohl Pollen- als auch Nicht-Pollen-Allergene 1. Bei Untersuchungen zur Schwellendosis wurden so geringe Provokationsdosen wie 1 mg Haselnussprotein 1 in Berichten angefhrt. Haselnusshaltiges Material kann aus verschiedenen Grnden
32、unbeabsichtigt in Lebensmitteln auftreten. Es kann in kontaminierten Zutaten vorliegen oder aufgrund einer whrend der Herstellung des Lebensmittels aufgetretenen Kreuzkontamination. Folglich besteht ein Bedarf an empfindlichen und zuverlssigen Unter-suchungsverfahren zum Nachweis von Haselnuss in Le
33、bensmittelproben. DIN CEN/TS 15633-3 (DIN SPEC 10700-2):2012-10 CEN/TS 15633-3:2012 (D) 5 1 Anwendungsbereich Diese Technische Spezifikation legt ein ELISA-Verfahren (enzymgebundener Immunosorbent-Test, en: Enzyme-linked immunosorbent assay) zur Bestimmung der Haselnusskonzentration in Lebensmittel-
34、proben fest. Zur Validierung der Anwendung des Verfahrens auf Lebensmittelmatrices, wie z. B. Mehrkorn-Zerealien, fein-herbe Schokolade (45 % Kakao) und Eiscreme, wurden Aufstockversuche unter Verwendung von verdnnter gemahlener Haselnuss durchgefhrt. Der Bereich des Verfahrens reicht von 0,5 mg bis
35、 5,0 mg Hasel-nussprotein je kg Lebensmittelprobe. Da Haselnusskerne blicherweise zwischen 12 % bis 15 % Protein enthalten 2, 3, entspricht das etwa 3,7 mg bis 37 mg Haselnusskernen je kg Lebensmittelprobe. Die obere Grenze des Quantifizierungsbereichs kann bei Bedarf durch weitere Verdnnung von Pro
36、benextrakten erweitert werden. Das Verfahren ist im Handel erhltlich1)und wurde vom Hersteller intern validiert. Die Daten sind in Anhang A.2 enthalten. Das Verfahren wurde in einem Ringversuch erfolgreich validiert. Der Versuch wurde von der Arbeitsgruppe organisiert, die vom Bundesamt fr Verbrauch
37、erschutz und Lebensmittelsicherheit (BVL) zur Durchfhrung von 64 des Lebensmittel-, Bedarfsgegenstnde- und Futtermittelgesetzbuches (LFGB) fr die Bestimmung des Haselnussgehaltes in feinherber Schokolade eingerichtet wurde. Es nahmen 13 deutsche Laboratorien teil. Die Daten sind in Anhang A.3 enthal
38、ten. 2 Normative Verweisungen Die folgenden Dokumente, die in diesem Dokument teilweise oder als Ganzes zitiert werden, sind fr die Anwendung dieses Dokuments erforderlich. Bei datierten Verweisungen gilt nur die in Bezug genommene Ausgabe. Bei undatierten Verweisungen gilt die letzte Ausgabe des in
39、 Bezug genommenen Dokuments (einschlielich aller nderungen). EN 15633-1:2008, Lebensmittel Nachweis von Lebensmittelallergenen mit immunologischen Verfahren Teil 1: Allgemeine Betrachtungen 3 Begriffe Fr die Anwendung dieses Dokuments gelten die Begriffe nach EN 15633-1. 4 Kurzbeschreibung Fr den Na
40、chweis von Haselnussprotein wird ein direkter enzymgebundener Immunosorbent-Test (ELISA) in Form eines Sandwichtests verwendet. Unter Anwendung einer Polyacrylamidgel-Elektrophorese wurde eine Proteinbande bei 13 kDa bis 14 kDa ermittelt, die sowohl bei rohen als auch bei gersteten Haselnssen vorlie
41、gt. Dieser Proteinmarker wurde mit Hochleistungs-Flssigkeitschromatographie gereinigt und zur Erzeugung von polyklonalen Kaninchen-Antiseren gegen Haselnussprotein verwendet. Die IgG-Fraktion dieses Antiserums wurde mit Affinitts-chromatographie gereinigt und anschlieend wie nachstehend beschrieben
42、fr die Entwicklung eines direkten Sandwich-ELISA verwendet. 1) ELISA Systems Hazelnut Residue ELISA ist die Herstellerbezeichnung des Produktes, geliefert von ELISA Systems Pty Ltd, Brisbane, Australien. Diese Angabe dient zur Unterrichtung der Anwender dieser Technischen Spezifikation und bedeutet
43、keine Anerkennung des genannten Produktes durch CEN. Gleichwertige Produkte drfen verwendet werden, wenn sie nachweisbar zu identischen Ergebnissen fhren. DIN CEN/TS 15633-3 (DIN SPEC 10700-2):2012-10 CEN/TS 15633-3:2012 (D) 6 1) Lsliches Haselnussprotein wird aus der Lebensmittelprobe extrahiert. 2
44、) Der Extrakt wird anschlieend in mit immobilisierten Antikrpern gegen Haselnuss beschichtete Kavitten einer Mikrotiterplatte gegeben. Nach der Reaktion der Probe wird grndlich gewaschen. 3) Das Konjugat (mit Meerrettichperoxidase markierte Antikrper gegen Haselnuss) wird anschlieend hinzugefgt, rea
45、gieren gelassen und alles wird grndlich gewaschen. Das in Schritt 2 angelagerte Haselnussprotein bindet unter Bildung eines Sandwiches das Konjugat. 4) Tetramethylbenzidin (TMB), das chromogene Substrat, wird hinzugefgt und reagieren gelassen. Haselnussprotein-Antikrper-Sandwiches fhren zur Entwickl
46、ung einer blauen Frbung. 5) Die Reaktion wird durch Zugabe von 1 mol/l Phosphorsure gestoppt, was einen Farbumschlag nach Gelb bewirkt. Zur Messung der optischen Dichte (OD) jeder Kavitt wird ein Spektrophotometer (Primrwellenlnge 450 nm und Referenzwellenlnge zwischen 620 nm und 650 nm) eingesetzt.
47、 Die erzeugte OD wird durch die Konzentration des Haselnussproteins bedingt. Die Haselnusskonzentration einer Probe kann durch Vergleich der durch die Probe erzeugten OD mit der durch Standards erzeugten OD berechnet werden. Die Standards werden in mg Haselnussprotein je kg kalibriert. Sie wurden au
48、s einem wssrigen Extrakt handelsblicher Haselnsse (Corylus avellana) hergestellt. Die Proteinkonzentration wurde nach dem Lowry-Verfahren bestimmt. 5 Reagenzien 5.1 Gewhnlich mit dem Test Kit gelieferte Reagenzien: 5.1.1 Extraktionslsung Die routinemig verwendete Extraktionslsung ist eine phosphatgepufferte Kochsalzlsung mit Tween 20 (PBST). Die Lsung wird als 20-fach
