1、Mrz 2009 Normenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL) im DINPreisgruppe 9DIN Deutsches Institut fr Normung e.V. Jede Art der Vervielfltigung, auch auszugsweise, nur mit Genehmigung des DIN Deutsches Institut fr Normung e.V., Berlin, gestattet.ICS 07.100.30; 65.120!$NDG“1433336
2、www.din.deDVornormDIN CEN/TS 15790Futtermittel PCR-Typisierung der probiotischen Stmme von Saccharomycescerevisiae (Hefe);Deutsche Fassung CEN/TS 15790:2008Animal feeding stuffs PCR typing of probiotic strains of Saccharomyces cerevisiae (yeast);German version CEN/TS 15790:2008Aliments des animaux T
3、ypage ACP des souches probiotiques de Saccharomyces cerevisiae (levure);Version allemande CEN/TS 15790:2008Alleinverkauf der Normen durch Beuth Verlag GmbH, 10772 Berlin www.beuth.deGesamtumfang 14 SeitenDIN CEN/TS 15790:2009-03 2 Nationales Vorwort Diese Technische Spezifikation (CEN/TS 15790:2008)
4、 wurde vom Technischen Komitee VEN/TC 327 Futtermittel Probenahme- und Untersuchungsverfahren“ (Sekretariat: NEN, Niederlande) des Europischen Komitees fr Normung (CEN) erarbeitet. Die Mitarbeit des DIN beim Europischen Komitee fr Normung (CEN) wird fr den Bereich des CEN/TC 327 ber das nationale Sp
5、iegelgremium, den Arbeitsausschuss NA 057-03-03 AA Futtermittel“ des Normenausschusses Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL) wahrgenommen. Eine Vornorm ist das Ergebnis einer Normungsarbeit, das wegen bestimmter Vorbehalte zum Inhalt oder wegen des gegenber einer Norm abweichenden Aufs
6、tellungsverfahrens vom DIN noch nicht als Norm herausgegeben wird. Dieses Dokument wurde unter einem Mandat erarbeitet, das die Europische Kommission und die Europische Freihandelszone dem CEN erteilt haben, und untersttzt grundlegende Anforderungen der EG-Richtlinien. Zur vorliegenden Vornorm wurde
7、 kein Entwurf verffentlicht. Erfahrungen mit dieser Vornorm sind erbeten vorzugsweise als Datei per E-Mail an naldin.de in Form einer Tabelle. Die Vorlage dieser Tabelle kann im Internet unter http:/www.din.de/stellungnahme abgerufen werden; oder in Papierform an den Normenausschuss Lebensmittel und
8、 landwirtschaftliche Produkte (NAL) im DIN Deutsches Institut fr Normung e. V., Burggrafenstrae 6, 10787 Berlin. Vornorm TECHNISCHE SPEZIFIKATION TECHNICAL SPECIFICATION SPCIFICATION TECHNIQUE CEN/TS 15790 Dezember 2008 ICS 07.100.30; 65.120 Deutsche Fassung Futtermittel PCR-Typisierung der probioti
9、schen Stmme von Saccharomyces cerevisiae (Hefe) Animal feeding stuffs PCR typing of probiotic strains of Saccharomyces cerevisiae (yeast) Aliments des animaux Typage ACP des souches probiotiques de Saccharomyces cerevisiae (levure) Diese Technische spezifikation (CEN/TS) wurde vom CEN am 25. August
10、2008 als eine knftige Norm zur vorlufigen Anwendung angenommen. Die Gltigkeitsdauer dieser CEN/TS ist zunchst auf drei Jahre begrenzt. Nach zwei Jahren werden die Mitglieder des CEN gebeten, ihreStellungnahmen abzugeben, insbesondere ber die Frage, ob die CEN/TS in eine Europische Norm umgewandelt w
11、erden kann. Die CEN Mitglieder sind verpflichtet, das Vorhandensein dieser CEN/TS in der gleichen Weise wie bei einer EN anzukndigen und dieCEN/TS verfgbar zu machen. Es ist zulssig, entgegenstehende nationale Normen bis zur Entscheidung ber eine mgliche Umwandlung der CEN/TS in eine EN (parallel zu
12、r CEN/TS) beizubehalten. CEN-Mitglieder sind die nationalen Normungsinstitute von Belgien, Bulgarien, Dnemark, Deutschland, Estland, Finnland, Frankreich,Griechenland, Irland, Island, Italien, Lettland, Litauen, Luxemburg, Malta, den Niederlanden, Norwegen, sterreich, Polen, Portugal,Rumnien, Schwed
13、en, der Schweiz, der Slowakei, Slowenien, Spanien, der Tschechischen Republik, Ungarn, dem Vereinigten Knigreich und Zypern. EUROPISCHES KOMITEE FR NORMUNG EUROPEAN COMMITTEE FOR STANDARDIZATION COMIT EUROPEN DE NORMALISATIONManagement-Zentrum: rue de Stassart, 36 B-1050 Brssel 2008 CEN Alle Rechte
14、der Verwertung, gleich in welcher Form und in welchem Verfahren, sind weltweit den nationalen Mitgliedern von CEN vorbehalten.Ref. Nr. CEN/TS 15790:2008 DCEN/TS 15790:2008 (D) 2 Inhalt Seite Vorwort 3 Einleitung.4 1 Anwendungsbereich .5 2 Kurzbeschreibung .5 3 Reagenzien.5 3.1 PCR .5 3.1.1 Primer5 3
15、.1.2 dNTP-Mix 5 3.1.3 Puffer.6 3.1.4 Magnesiumchloridlsung .6 3.1.5 DNA-Taq-Polymerase 6 3.2 Gelelektrophorese .6 3.2.1 Agarose, Agarose von molekularer Qualitt, frei von DNase- und RNase-Verunreinigung. .6 3.2.2 Molekulargewichtsmarker.6 3.2.3 Tris-Borat-EDTA-Puffer .6 3.2.4 Farbmarker, Probenauftr
16、agepuffer (Loading dye) .6 3.2.5 Wasser 6 3.2.6 Ethidiumbromid .6 4 Gerte6 4.1 PCR .6 4.1.1 PCR-Rhrchen .6 4.1.2 Pipettierer und sterile Tips .7 4.1.3 Thermocycler .7 4.2 Gelelektrophorese .7 4.2.1 Horizontales Gelelektrophorese-System 7 4.2.2 Mikrowellenofen.7 4.2.3 Erlenmeyerkolben7 4.2.4 Waage .7
17、 4.2.5 Transilluminator.7 4.2.6 Bildanalyse-System oder Polaroid-Kamera 7 5 Durchfhrung.7 5.1 PCR-Reaktion.7 5.2 Thermozyklus.8 5.3 Agarose-Gelelektrophorese8 6 Analyse der Ergebnisse 9 Anhang A (informativ) Beispielgel PCR der probiotischen Stmme von Saccaromyces cerevisiae. 10 Anhang B (informativ
18、) Angaben zur Validierung des europischen Ringversuchs 4, 5 11 Literaturhinweise . 12 DIN CEN/TS 15790:2009-03 Vornorm CEN/TS 15790:2008 (D) 3 Vorwort Dieses Dokument (CEN/TS 15790:2008) wurde vom Technischen Komitee CEN/TC 327 Futtermittel Probenahme- und Untersuchungsverfahren“ erarbeitet, dessen
19、Sekretariat vom NEN gehalten wird. Es wird auf die Mglichkeit hingewiesen, dass einige Texte dieses Dokuments Patentrechte berhren knnen. CEN und/oder CENELEC sind nicht dafr verantwortlich, einige oder alle diesbezglichen Patentrechte zu identifizieren. Dieses Dokument wurde unter einem Mandat erar
20、beitet, das die Europische Kommission und die Europische Freihandelszone dem CEN erteilt haben, und untersttzt grundlegende Anforderungen der EG-Richtlinien. Entsprechend der CEN/CENELEC-Geschftsordnung sind die nationalen Normungsinstitute der folgenden Lnder gehalten, diese Technische Spezifikatio
21、n anzukndigen: Belgien, Bulgarien, Dnemark, Deutschland, Estland, Finnland, Frankreich, Griechenland, Irland, Island, Italien, Lettland, Litauen, Luxemburg, Malta, Niederlande, Norwegen, sterreich, Polen, Portugal, Rumnien, Schweden, Schweiz, Slowakei, Slowenien, Spanien, Tschechische Republik, Unga
22、rn, Vereinigtes Knigreich und Zypern. DIN CEN/TS 15790:2009-03 Vornorm CEN/TS 15790:2008 (D) 4 Einleitung Diese Methodik basiert auf einer bestimmten Polymerase-Kettenreaktion-(PCR, en: Polymerase chain reaction)-Amplifikation einer genetischen Sequenz fr den Nachweis von aus Tierfuttermitteln oder
23、aus probiotischen Zustzen von Tierfuttermitteln isolierte Saccharomyces cerevisiae. Das Ziel dieses Verfahrens ist die Bestimmung autorisierter probiotischer Hefestmme. Molekulare Typisierungsverfahren und besonders die Verfahren auf der Grundlage der PCR-Amplifikation, die zur Charakterisierung der
24、 Hefestmme angewendet werden, bentigen hochreine hochmolekulare genomische DNA. Das DNA-Extraktionsverfahren aus der Hefe muss diese Anforderungen ermglichen. DIN CEN/TS 15790:2009-03 Vornorm CEN/TS 15790:2008 (D) 5 1 Anwendungsbereich Diese Technische Spezifikation legt eine Polymerase-Kettenreakti
25、on-(PCR)-Methodik fr die Identifizierung von probiotischen Saccharomyces cerevisiae-Hefestmmen fest. Zustzlich wird ein Verfahren fr die Extraktion hochreiner DNA der Hefe vorgeschlagen. 2 Kurzbeschreibung Dieses Verfahren basiert auf der Amplifikation von -Elementen, die in dem Hefegenom vorhanden
26、sind. Zwei Primer werden fr die PCR-Reaktion bentigt, die eine Modifikation von Ness et al. 1 sind. Eindeutige Muster werden bei probiotischen Stmmen von S. cerevisiae erzielt, wenn sie in Agarose-Gel durch Elektrophorese getrennt werden. Nach der Frbung des Agarose-Gels mit Ethidiumbromid sind die
27、Muster unter UV-Licht sichtbar. Die PCR-Analyse von aus Agarplatten isolierten einzelnen Hefekolonien schliet die folgenden Schritte ein: 1. DNA-Extraktion und -Reinigung; 2. PCR-Reaktion; 3. Gelelektrophorese; 4. Analyse der Ergebnisse. Einzelne und typische Kolonien knnen folgend des Wachstums auf
28、 geeigneten Agarmedium gewonnen werden, deshalb wird das Standardzhlverfahren empfohlen, das Hefeextrakt-Dextrose-Chloramphenicol-Agar (CGYE) 1 anwendet. Typische Kolonien werden aus Agarplatten aufgesammelt, um 10 ml Malzextrakt-Agar zu beimpfen, welches ber Nacht bei 30 C in einem Schttelinkubator
29、, z. B. einem Orbital-Inkubator, der mit 100 min-1rotiert, oder hnlichem kultiviert wird. Die Zellen werden anschlieend geerntet und DNA wird aus Hefezellen, den Anweisungen des Herstellers folgend, mit Probenkits oder geeigneten Verfahren extrahiert. Das DNA-Extraktionsverfahren ist ein sequentiell
30、er Vorgang der Entfernung der ueren Zellwand, der Lyse des Zellkerns, der Proteinprzipitation und -entfernung, gefolgt von der Przipitation der Nuklein-sure. Ein Extraktionsverfahren wird z. B. durch Hoffman und Winston 2 beschrieben. 3 Reagenzien 3.1 PCR 3.1.1 Primer Die folgenden Primer-Sequenzen
31、werden angewendet: Delta 1 modifizierter Primer: 5 CAA ATT CAC CTA TTT CTC A 3 Delta 2 Primer: 5 GTG GAT TTT TAT TCC AAC A 3 Stammlsungen von jedem Primer werden durch Verdnnung in sterilem Wasser (3.2.5) auf eine End-konzentration von 50 mol/l hergestellt und diese bei mindestens 20 C aufbewahrt. 3
32、.1.2 dNTP-Mix Ein 2 mmol/l quimolare Stammlsung von dATP, dTTP, dGTP, dCTP wird aus einem dNTP-Mixset hergestellt und bei mindestens 20 C aufbewahrt. DIN CEN/TS 15790:2009-03 Vornorm CEN/TS 15790:2008 (D) 6 3.1.3 Puffer Eine handelsbliche 10fache Stammlsung eines Reaktionspuffers (en: Reaction Buffe
33、r) wird verwendet. Die Zusammensetzung besteht aus 100 mmol/l Tris-HCl (pH-Wert 9,0), 500 mmol/l KCl und 1 % (V/V) Triton X-100. Der Puffer wird bei mindestens 20 C aufbewahrt. 3.1.4 Magnesiumchloridlsung Eine handelsbliche 10fache Stammlsung wird verwendet und bei mindestens 20 C aufbewahrt. Die Zu
34、sammensetzung besteht aus 25 mmol/l Magnesiumchlorid (MgCl2). 3.1.5 DNA-Taq-Polymerase Verwendet wird eine DNA-Taq-Polymerase mit einer Konzentration von 5 U/l, diese wird bei mindestens 20 C aufbewahrt. Alternativ darf eine geeignete Enzymaufbereitung angewendet werden. 3.2 Gelelektrophorese 3.2.1
35、Agarose, Agarose von molekularer Qualitt, frei von DNase- und RNase-Verunreinigung. 3.2.2 Molekulargewichtsmarker Eine 100-bp-Leiter (en: Ladder) wird empfohlen. 3.2.3 Tris-Borat-EDTA-Puffer Handelsblich hergestelltes 10faches TBE, mit destilliertem Wasser auf 1fach verdnnt (z. B. von Sigma). TBE (1
36、fach) ist aus 89 mmol/l Tris-Borat-EDTA-Puffer, pH-Wert 8,3, zusammengesetzt, die 2 mmol/l EDTA enthlt. 3.2.4 Farbmarker, Probenauftragepuffer (Loading dye) Verwendet wird eine handelsblich hergestellter 6facher Farbmarker. Dieser ist aus 0,4 % Orange G, 0,03 % Bromphenolblau, 0,03 % Xylencyanol FF,
37、 15 % Ficoll 400, 10 mmol/l tris-HCl (pH-Wert 7,5) und 50 mmol/l EDTA (pH-Wert 8,0) zusammengesetzt. Geeignete alternative Standard-Farbmarker drfen ebenso angewendet werden. 3.2.5 Wasser DNase und RNase frei, 18 , 0,2 m filtriert. 3.2.6 Ethidiumbromid Eine handelsblich hergestellte 10 mg/ml Lsung w
38、ird verwendet. 4 Gerte Die fr ein Molekularlaboratorium geeignete Ausrstung und insbesondere: 4.1 PCR 4.1.1 PCR-Rhrchen Dnnwandige DNAse-freie Mikrorhrchen, geeignet fr den angewendeten Thermocycler. DIN CEN/TS 15790:2009-03 Vornorm CEN/TS 15790:2008 (D) 7 4.1.2 Pipettierer und sterile Tips Geeignet
39、 fr die Abgabe zwischen 0,5 l und 200 l. 4.1.3 Thermocycler Ein geeigneter und zuverlssiger Thermocycler, der technisch gewartet und kalibriert ist. 4.2 Gelelektrophorese 4.2.1 Horizontales Gelelektrophorese-System Einschlielich Zelle und Netzgert, geeignet fr den Betrieb bei einer konstanten Spannu
40、ng. 4.2.2 Mikrowellenofen 4.2.3 Erlenmeyerkolben Volumen 250 ml fr die 80-ml- bis 100-ml-Agarose-Vorbereitung. 4.2.4 Waage Geeignet, um auf 0,01 g zu wgen. 4.2.5 Transilluminator Gert, das am besten geeignet ist, die Bandmuster in dem Agarosegel nach der Ethidiumbromid-Frbung sichtbar zu machen. 4.2
41、.6 Bildanalyse-System oder Polaroid-Kamera Geeignetes System, um die Ergebnisse aufzuzeichnen und zu analysieren. 5 Durchfhrung 5.1 PCR-Reaktion Dieses Verfahren wurde etwas abgendert, um die Modifikation des Delta 1 Primer 1 einzubinden. Delta 1 modifizierter Primer: 5 CAA ATT CAC CTA TTT CTC A 3;
42、Delta 2 Primer: 5 GTG GAT TTT TAT TCC AAC A 3. Fr jede PCR-Analyse wird eine Vormischung, die alle Reagenzien auer der DNA-Matrize enthlt, nach Tabelle 1 vorbereitet. DIN CEN/TS 15790:2009-03 Vornorm CEN/TS 15790:2008 (D) 8 Tabelle 1 PCR-Reaktionsgemisch Stamm Reaktion Volumen l/Rhrchen erforderlich
43、 Puffer 10fach 1fach 5 dNTPs 2 mmol/l 200 mol/l 5 MgCl225 mmol/l 1,5 mmol/l 3 Delta 1 modifizierter Primer 50 mol/l 1 mol/l 1 Delta 2 Primer 50 mol/l 1 mol/l 1 Taq-Polymerase 5 U/l 2,5 U/l 0,5 H2O (bis 48 l) 32,5 Das Reaktionsgemisch wird in Aliquoten von 48 l in die PCR-Rhrchen aufgeteilt und auf E
44、is aufbewahrt, bis die Matrize zugegeben wurde und die Rhrchen fertig zum Beladen des Thermocyclers sind. 2 l DNA-Matrize sind zu dem Endreaktionsgemisch hinzuzufgen (oder 2 l Wasser (3.2.5) fr die Blind-probe). 5.2 Thermozyklus Dieser Arbeitsschritt ist ausschlaggebend und erfordert deshalb besonde
45、re Sorgfalt, um abzusichern, dass der angewendete Thermocycler hinsichtlich seiner Leistungsfhigkeit zuverlssig ist, die festgelegten Zeit-Temperatur-Zyklen reproduzierbar einzuhalten. Es wird vorgeschlagen, dass das in diesem Fall durch das fr das Gert zutreffende geeignete Normungsverfahren sicher
46、gestellt wird. 95 C - 2 min Zyklen4min 2 - C 72s 30 - C 45s 30 - C 95Zyklen30min 2- C 72s 30- C 45s 30- C 9572 C - 10 min 4 C - 8 min 5.3 Agarose-Gelelektrophorese Ein 2%iges (w/v) Agarose-Gel wird mit Agarose mit einer fr die Molekularbiologie geeigneten Qualitt und 1fachem TBE hergestellt. Ethidiu
47、mbromid wird bis zu einer Endkonzentration von 0,1 g/ml hinzugegeben. Der Laufpuffer besteht aus 1fachem TBE mit einer Endkonzentration von 0,5 g/ml Ethidiumbromid. 10 l des Farbmakers werden zu der Reaktion hinzugefgt und gemischt. 20 l Reaktionsgemisch und Farb-stoff werden in ein Rohr fr jede Rea
48、ktion eingebracht. Der verwendete Marker der relativen Moleklmasse ist eine 100-bp-Leiter. Das Produkt wird bei einer Spannung von 150 V mit einer Laufzeit von 45 min bis 60 min mitlaufen gelassen. Das Gel wird unter UV-Licht sichtbar gemacht. DIN CEN/TS 15790:2009-03 Vornorm CEN/TS 15790:2008 (D) 9
49、 6 Analyse der Ergebnisse Fr die Analyse der Ergebnisse wird ein Referenzphoto eines Agarose-Gels (Anhang A) mit eindeutigen Mustern von autorisierten probiotischen S. cerevisiae Stmmen und einem handelsblich verfgbaren Referenzstamm (S. cerevisiae NCYC 81) herangezogen. Die so erhaltenen Bandmuster werden mit den
