1、September 2011 Normenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL) im DINPreisgruppe 9DIN Deutsches Institut fr Normung e. V. Jede Art der Vervielfltigung, auch auszugsweise, nur mit Genehmigung des DIN Deutsches Institut fr Normung e. V., Berlin, gestattet.ICS 67.120.30Zur Erstellun
2、g einer DIN SPEC knnen verschiedene Verfahrensweisen herangezogen werden: Das vorliegende Dokument wurde nach den Verfahrensregeln einer Vornorm erstellt.!$lpp“1737777www.din.deDDIN CEN/TS 16233-2Lebensmittel HPLC-Verfahren fr die Bestimmung von Xanthophyllen inFischfleisch Teil 2: Bestimmung des En
3、antiomerenverhltnisses von Astaxanthin;Deutsche Fassung CEN/TS 16233-2:2011Foodstuffs HPLC method for the determination of xanthophylls in fish flesh Part 2: Identification of the enantiomer ratio of astaxanthin;German version CEN/TS 16233-2:2011Produits alimentaires Mthode de dosage des xanthophyll
4、es dans la chair de poisson par CLHP Partie 2: Identification de la distribution nantiomrique de lastaxanthine;Version allemande CEN/TS 16233-2:2011Alleinverkauf der Spezifikationen durch Beuth Verlag GmbH, 10772 Berlin www.beuth.deGesamtumfang 14 SeitenDIN SPEC 91050-2DIN CEN/TS 16233-2 (DIN SPEC 9
5、1050-2):2011-09 Nationales Vorwort Dieses Dokument (CEN/TS 16233-2:2011) wurde vom CEN/TC 275 Lebensmittelanalytik Horizontale Verfahren“ (Sekretariat DIN, Deutschland) erarbeitet. Der national zustndige Arbeitsausschuss ist der NA 057-01-13 AA Vitamine und Carotinoide“ im Normenausschuss Lebensmitt
6、el und landwirtschaftliche Produkte (NAL). Eine DIN SPEC nach dem Vornorm-Verfahren ist das Ergebnis einer Normungsarbeit, das wegen bestimmter Vorbehalte zum Inhalt oder wegen des gegenber einer Norm abweichenden Aufstellungsverfahrens vom DIN noch nicht als Norm herausgegeben wird. Zur vorliegende
7、n DIN SPEC wurde kein Entwurf verffentlicht. Erfahrungen mit dieser DIN SPEC sind erbeten vorzugsweise als Datei per E-Mail an naldin.de in Form einer Tabelle. Die Vorlage dieser Tabelle kann im Internet unter http:/www.din.de/stellungnahme abgerufen werden; oder in Papierform an den Normenausschuss
8、 Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL) im DIN, 10772 Berlin (Hausanschrift: Burggrafenstrae 6, 10787 Berlin). 2 TECHNISCHE SPEZIFIKATION TECHNICAL SPECIFICATION SPCIFICATION TECHNIQUE CEN/TS 16233-2 Juli 2011 ICS 67.120.30 Deutsche Fassung Lebensmittel HPLC-Verfahren zur Bestimmung von
9、 Xanthophyllen in Fischfleisch Teil 2: Bestimmung des Enantiomerenverhltnisses von Astaxanthin Foodstuffs HPLC method for the determination of xanthophylls in fish flesh Part 2: Identification of the enantiomer ratio of astaxanthinProduits alimentaires Mthode de dosage des xanthophylles dans la chai
10、r de poisson par CLHP Partie 2: Identification de la distribution nantiomrique de lastaxanthine Diese Technische spezifikation (CEN/TS) wurde vom CEN am 28. Mai 2011 als eine knftige Norm zur vorlufigen Anwendung angenommen. Die Gltigkeitsdauer dieser CEN/TS ist zunchst auf drei Jahre begrenzt. Nach
11、 zwei Jahren werden die Mitglieder des CEN gebeten, ihre Stellungnahmen abzugeben, insbesondere ber die Frage, ob die CEN/TS in eine Europische Norm umgewandelt werden kann. Die CEN Mitglieder sind verpflichtet, das Vorhandensein dieser CEN/TS in der gleichen Weise wie bei einer EN anzukndigen und d
12、ie CEN/TS verfgbar zu machen. Es ist zulssig, entgegenstehende nationale Normen bis zur Entscheidung ber eine mgliche Umwandlung der CEN/TS in eine EN (parallel zur CEN/TS) beizubehalten. CEN-Mitglieder sind die nationalen Normungsinstitute von Belgien, Bulgarien, Dnemark, Deutschland, Estland, Finn
13、land, Frankreich, Griechenland, Irland, Island, Italien, Kroatien, Lettland, Litauen, Luxemburg, Malta, den Niederlanden, Norwegen, sterreich, Polen, Portugal, Rumnien, Schweden, der Schweiz, der Slowakei, Slowenien, Spanien, der Tschechischen Republik, Ungarn, dem Vereinigten Knigreich und Zypern.
14、EUROPISCHES KOMITEE FR NORMUNG EUROPEAN COMMITTEE FOR STANDARDIZATION COMIT EUROPEN DE NORMALISATIONManagement-Zentrum: Avenue Marnix 17, B-1000 Brssel 2011 CEN Alle Rechte der Verwertung, gleich in welcher Form und in welchem Verfahren, sind weltweit den nationalen Mitgliedern von CEN vorbehalten.R
15、ef. Nr. CEN/TS 16233-2:2011 DCEN/TS 16233-2:2011 (D) 2 Inhalt Seite Vorwort 3 Einleitung.4 1 Anwendungsbereich .5 2 Normative Verweisungen5 3 Kurzbeschreibung .5 4 Chemikalien6 5 Gerte7 6 Probenvorbereitung und Extraktion 7 6.1 Extraktion im groen Mastab .7 6.2 Extraktion im kleinen Mastab.8 7 HPLC
16、.8 7.1 Identifizierung 8 7.2 Bedingungen8 7.3 Retentionszeiten 9 7.4 Berechnung10 8 Untersuchungsbericht 11 Literaturhinweise 12 DIN CEN/TS 16233-2 (DIN SPEC 91050-2):2011-09 CEN/TS 16233-2:2011 (D) 3 Vorwort Dieses Dokument (CEN/TS 16233-2:2011) wurde vom Technischen Komitee CEN/TC 275 Lebensmittel
17、analytik Horizontale Verfahren“ erarbeitet, dessen Sekretariat vom DIN gehalten wird. Es wird auf die Mglichkeit hingewiesen, dass einige Texte dieses Dokuments Patentrechte berhren knnen. CEN und/oder CENELEC sind nicht dafr verantwortlich, einige oder alle diesbezglichen Patentrechte zu identifizi
18、eren. Entsprechend der CEN/CENELEC-Geschftsordnung sind die nationalen Normungsinstitute der folgenden Lnder gehalten, diesen anzukndigen: Belgien, Bulgarien, Dnemark, Deutschland, Estland, Finnland, Frankreich, Griechenland, Irland, Island, Italien, Kroatien, Lettland, Litauen, Luxemburg, Malta, Ni
19、ederlande, Norwegen, sterreich, Polen, Portugal, Rumnien, Schweden, Schweiz, Slowakei, Slowenien, Spanien, Tschechische Republik, Ungarn, Vereinigtes Knigreich und Zypern. DIN CEN/TS 16233-2 (DIN SPEC 91050-2):2011-09 CEN/TS 16233-2:2011 (D) 4 Einleitung Von (all-E)-Astaxanthin gibt es drei Stereois
20、omere (zwei Enantiomere und eine meso-Form), die als (3R,3R)-, (3S,3S)- und (3R,3S,meso)-(all-E)-Astaxanthin bezeichnet werden, siehe Bild 1. Diese Isomere knnen durch Chromatographie an einer chiralen HPLC-Sule bestimmt werden. Lachsfische nehmen ihr Astaxanthin ber die Nahrung auf und die Isomeren
21、zusammensetzung des Fleisches entspricht derjenigen des mit der Nahrung aufgenommenen Astaxanthins. Synthetisch hergestelltes (racemisches) Astaxanthin und alternative organische Formen von Astaxanthin (hergestellt von Mikroorganismen wie z. B. Xanthophyllomyces dendrorhous frher Phaffia rhodozyma u
22、nd Haematococcus pluvialis) weisen unterschiedliche Stereoisomerenprofile auf, siehe Bild 2. Auch wenn die Unterschiede in der Bioverfgbarkeit dieser Formen bei Fischen geringfgig sind 1, 2, kann das sich ergebende Isomerenprofil fr das Fleisch verwendet werden, um Wildlachs von Zuchtlachs zu unters
23、cheiden und um zu bestimmen, mit welcher Form von Astaxanthin das Futter von Zuchtarten angereichert wurde 3, 4, 5. Die Ergebnisse sollten kritisch betrachtet werden, da gelegentlich die Gruppen von Zuchtlachs, die whrend der Dauer des Produktionszyklus mit Futter mit gemischten Astaxanthinquellen o
24、der Futter unterschiedlicher Herkunft gefttert wurden, mit dem Verfahren nicht unterschieden werden knnen 6. Auerdem wurden in der Garnelenart Penaeus und auch in einigen anderen Ordnungen hherer Krebse racemische Astaxanthin-Gemische beobachtet. Deshalb kann Fisch, der ausschlielich mit Garnelenmeh
25、l gefttert wurde, auch racemisches Astaxanthin enthalten 7, 8 und flschlich fr Fisch gehalten werden, der mit synthetischem Astaxanthin gefttert wurde. DIN CEN/TS 16233-2 (DIN SPEC 91050-2):2011-09 CEN/TS 16233-2:2011 (D) 5 1 Anwendungsbereich Das vorliegende Dokument beschreibt ein Verfahren zur Be
26、stimmung des Enatiomerenverhltnisses von Astaxanthin in Fischfleisch mit Hochleistungsflssigchromatographie (HPLC). 2 Normative Verweisungen Die folgenden zitierten Dokumente sind fr die Anwendung dieses Dokuments erforderlich. Bei datierten Verweisungen gilt nur die in Bezug genommene Ausgabe. Bei
27、undatierten Verweisungen gilt die letzte Ausgabe des in Bezug genommenen Dokuments (einschlielich aller nderungen). EN ISO 3696:1995, Wasser fr analytische Laborzwecke Spezifikation und Prfverfahren (ISO 3696:1987) 3 Kurzbeschreibung Das Fischfleisch wird durch Homogenisieren des Gewebes in Aceton e
28、xtrahiert. Der Extrakt wird filtriert und unter vermindertem Druck mit einem Rotationsverdampfer oder unter einem Stickstoffstrom bei 50 C verdampft. Abschlieend wird der Rckstand in der mobilen Phase, einer Mischung aus n-Heptan, Dichlormethan und Ethanol, gelst. Das Verhltnis von (3R,3R)-, (3R,3S,
29、meso)- und (3S,3S)-(all-E)-Astaxanthin wird durch Chromatographie an einer chiralen HPLC-Sule bestimmt. (3R,3R)-(all-E)-Astaxanthin (3S,3S)-(all-E)-Astaxanthin (3R,3S)-(all-E)-Astaxanthin Bild 1 Enantiomere und meso-Form von (all-E)-Astaxanthin DIN CEN/TS 16233-2 (DIN SPEC 91050-2):2011-09 CEN/TS 16
30、233-2:2011 (D) 6 4 Chemikalien Falls nicht anders angegeben, werden bei der Analyse nur Wasser der Qualitt 1 nach EN ISO 3696:1995 und Chemikalien von anerkannter Analysenreinheit, z. B. zur Analyse (p. a.), verwendet. 4.1 Magnesiumsulfat, wasserfrei, Reinheit (komplexometrisch): 98 % 4.2 Butylhydro
31、xytoluol (BHT) (2,6-Di-tert-butyl-p-kresol), Reinheit (GC): 99 % 4.3 Tetrahydrofuran, Reinheit (GC): 99 %, stabilisiert mit 0,025 % 2,6-Di-tert-butyl-p-kresol (BHT) 4.4 Cyclohexan, Reinheit (GC): 99 % 4.5 n-Heptan, Reinheit (GC): 99 % 4.6 Dichlormethan, analysenrein, Reinheit (GC): 99 % 4.7 Aceton,
32、Reinheit (GC): 99 % 4.8 Ethanol, absolut, Reinheit (GC): 99 % 4.9 Mobile Phase fr die chirale HPLC, Lsemittel, isokratisch 24 Volumenteile n-Heptan (4.5) werden mit 58 Volumenteilen Dichlormethan (4.6) und 0,3 Volumenteilen Ethanol (4.8) gemischt. 4.10 Referenzsubstanzen von (all-E)-Astaxanthin und
33、(all-E)-Canthaxanthin, Reinheit (HPLC): 95 % Die Referenzsubstanzen werden bei etwa 20 C unter Stickstoff oder Argon aufbewahrt. Spuren von Sauerstoff zerstren die Substanzen. 4.11 Herstellung der Astaxanthin-Standardlsung, = 1,5 mg/ml Etwa 1,5 mg der Referenzsubstanz von (all-E)-Astaxanthin (4.10)
34、werden auf 0,1 mg in einen 100-ml-Mess-kolben eingewogen, und es wird 1 g BHT (4.2) zugegeben. Beide Substanzen werden in 5 ml Tetrahydrofuran (4.3) gelst und der Kolben wird bis zur Marke mit Tetrahydrofuran aufgefllt. Die Auflsung wird durch Behandlung mit Ultraschall untersttzt. Ein aliquoter Ant
35、eil dieser Lsung von 10 ml wird in einen 100-ml-Messkolben berfhrt, und etwa 85 ml n-Heptan (4.5) werden hinzugefgt. Die Mischung khlt ab und zieht sich zusammen“ (das Volumen verringert sich). Die Lsung wird auf Raumtemperatur erwrmt und der Kolben bis zur Marke mit n-Heptan aufgefllt. Das ergibt e
36、ine Astaxanthin-Konzentration von etwa 1,5 mg/l in einer Mischung aus 9 Volumenteilen n-Heptan und einem Volumenteil Tetrahydrofuran. 4.12 Herstellung der Canthaxanthin-Standardlsung, = 1,5 mg/ml Etwa 1,5 mg der Referenzsubstanz von (all-E)-Canthaxanthin (4.10) werden auf 0,1 mg in einen 100-ml-Mess
37、kolben eingewogen, und es wird 1 g BHT (4.2) zugegeben. Beide Substanzen werden in 5 ml Tetrahydrofuran (4.3) gelst und der Kolben wird bis zur Marke mit Tetrahydrofuran aufgefllt. Die Auflsung wird durch Behandlung mit Ultraschall untersttzt. Ein aliquoter Anteil dieser Lsung von 10 ml wird in eine
38、n 100-ml-Messkolben berfhrt, und etwa 85 ml Cyclohexan (4.4) werden hinzugefgt. Die Mischung khlt ab und zieht sich zusammen“ (das Volumen verringert sich). Die Lsung wird auf Raumtemperatur erwrmt und der Kolben bis zur Marke mit Cyclohexan aufgefllt. Das ergibt eine Canthaxanthin-Konzentration von
39、 etwa 1,5 mg/l in einer Mischung aus 9 Volumenteilen Cyclohexan und einem Volumenteil Tetrahydrofuran. 4.13 Herstellung einer Lsung von hitze-isomerisierten Carotinoiden (Kontrolllsung) Etwa 1,5 mg (all-E)-Astaxanthin (4.10), 1,5 mg (all-E)-Canthaxanthin (4.10) und 0,5 g BHT (4.2) werden auf 0,1 mg
40、gewogen und in einem 500-ml-Messkolben in 10 ml Tetrahydrofuran (4.3) gelst. Diese Lsung wird mit 200 ml einer Mischung aus 86 Volumenteilen n-Heptan (4.5) und 14 Volumenteilen Aceton (4.7) verdnnt. DIN CEN/TS 16233-2 (DIN SPEC 91050-2):2011-09 CEN/TS 16233-2:2011 (D) 7 Die Mischung wird 1 h in eine
41、m Wasserbad bei 80 C unter Rckfluss erhitzt. Nach dem Abkhlen auf Raumtemperatur wird die Lsung bis zur Marke mit der Mischung aus n-Heptan und Aceton verdnnt. Die Mischung wird in eine Vorratsflasche gegossen, gut gemischt, ber Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen und anschlieend in eine Vielza
42、hl von HPLC-Flschchen verteilt. Die Flschchen werden unverzglich sorgfltig mit Septa aus Polytetrafluorethylen (PTFE) und Silicon verschlossen und bei etwa 23 C im Dunkeln aufbewahrt. 5 Gerte bliche Laborgerte, Glasgerte und die Folgenden. 5.1 Messermhle, geeignet fr Lebensmittel, mit einem Mahlraum
43、volumen etwa 1 000 ml 5.2 Sinterglasfritte, Porositt 3 (16 m bis 40 m), Durchmesser: etwa 6 cm 5.3 Dispergiergert 5.3.1 Labor-Dispergiergert (Stativ-Dispergiergert) fr etwa 1 ml bis 2 000 ml, z. B. mit einem Dispergier-Aggregat mit einem Durchmesser von 20 mm 5.3.2 Hand-Dispergiergert fr etwa 1 ml b
44、is 250 ml, z. B. mit einem Dispergier-Aggregat mit einem Durchmesser von 12 mm 5.4 Rotationsverdampfer, z. B. 20 C bis 100 C 5.5 Verdampfer mit Stickstoffstrom, mit Heizblock und Pipettenhalter 5.6 Spektrometer, Wellenlngenbereich 190 nm bis 900 nm, Wellenlngengenauigkeit: 1 nm 5.7 Zentrifuge, Labor
45、tischzentrifuge fr mindestens 2 500 g 5.8 Waagen 5.8.1 Waage mit einer Ablesbarkeit von 0,01 g, Przision (Standardabweichung) von 0,005 g, Wgebereich 2 100 g 5.8.2 Waage mit einer Ablesbarkeit von 0,01 mg, Przision (Standardabweichung) von 0,015 mg, Wgebereich 205 g 5.9 SPE-Sulen, 25 ml Fassungsverm
46、gen, Kunststoff, ausgestattet mit Bodenfritten mit einer Porengre von 10 m 5.10 (Verteiler-)Modul fr die Festphasenextraktion, Stahlnadeln (0,90 mm 55 mm), angebracht an den Ventilauslssen 5.11 Chromatographisches System fr die HPLC, mit Sulenthermostat und UV/VIS- oder Diodenarraydetektor 6 Probenv
47、orbereitung und Extraktion 6.1 Extraktion im groen Mastab Etwa 100 g Gewebe werden mit einem Messer oder einer Schere in Stcke mit einer Lnge von etwa 1 cm geschnitten. Etwa 10 g bis 20 g des gehackten Gewebes werden auf 0,01 g in ein 200-ml-Becherglas eingewogen. 5 g Magnesiumsulfat (4.1), 50 mg BH
48、T (4.2) und 40 ml Aceton (4.7) werden hinzugefgt. Die DIN CEN/TS 16233-2 (DIN SPEC 91050-2):2011-09 CEN/TS 16233-2:2011 (D) 8 Mischung wird mit einem Dispergiergert (5.3.1) homogenisiert und bei Unterdruck durch eine Sinterglasfritte (5.2) filtriert. Der Rckstand wird abgeschabt und mit einer frisch
49、en Portion von etwa 40 ml Aceton erneut homogenisiert. Diese Verfahrensweise wird wiederholt, bis das Filtrat farblos ist (blicherweise 2 Extraktionen). Die Filtrate werden vereinigt, 20 ml Ethanol (4.8) werden hinzugefgt und die Mischung wird bei 50 C unter Anwendung eines Rotationsverdampfers (5.4) eingeengt. Der Rckstand wird durc
