1、Mai 2010DEUTSCHE NORM Normenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL) im DINPreisgruppe 11DIN Deutsches Institut fr Normung e.V. Jede Art der Vervielfltigung, auch auszugsweise, nur mit Genehmigung des DIN Deutsches Institut fr Normung e.V., Berlin, gestattet.ICS 67.050; 67.080.1
2、0!$YLj“1544171www.din.deDDIN EN 15829Lebensmittel Bestimmung von Ochratoxin A in Korinthen, Rosinen, Sultaninen,gemischtem Trockenobst und getrockneten Feigen HPLC-Verfahren mit Reinigung an einer Immunoaffinittssule undFluoreszenzdetektion;Deutsche Fassung EN 15829:2010Foodstuffs Determination of o
3、chratoxin A in currants, raisins, sultanas, mixed dried fruit and driedfigs HPLC method with immunoaffinity column cleanup and fluorescence detection;German version EN 15829:2010Produits alimentaires Dosage de lochratoxine A dans les raisins de Corinthe, les raisins secs, les raisins secsde Smyrne,
4、les mlanges de fruits secs et les figues sches Mthode CLHP avec purification sur colonne dimmunoaffinit et dtection parfluorescence;Version allemande EN 15829:2010Alleinverkauf der Normen durch Beuth Verlag GmbH, 10772 Berlin www.beuth.deGesamtumfang 17 SeitenDIN EN 15829:2010-05 Nationales Vorwort
5、Dieses Dokument (EN 15829:2010) ist vom Technischen Komitee CEN/TC 275 Lebensmittelanalytik Horizontale Verfahren“ (Sekretariat: DIN, Deutschland) des Europischen Komitees fr Normung (CEN) nach eingehenden Vorarbeiten der Arbeitsgruppe 5 Biotoxine“ erarbeitet worden. Das zustndige deutsche Arbeitsgr
6、emium ist der Arbeitsausschuss NA 057-01-03 AA Biotoxine“ des Normenausschusses Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte“ (NAL) im DIN Deutsches Institut fr Normung e. V. Mykotoxine sind stark gesundheitsschdliche sekundre Stoffwechselprodukte von Schimmelpilzen. Lebens-mittel, die unter feucht
7、en Bedingungen angebaut, geerntet oder gelagert werden, knnen von Schimmelpilzen befallen werden, deren Stoffwechselprodukte dann in das Lebensmittel gelangen. Die Toxizitt einiger Mykotoxine ist fr den Menschen erheblich; deshalb ist ein sicherer Nachweis von besonderer Bedeutung fr den gesundheitl
8、ichen Verbraucherschutz. In Deutschland gilt zur Verringerung der Mykotoxinbelastung die Mykotoxin-Hchstmengenverordnung. Sie enthlt seit 2004 nicht nur Regelungen fr Aflatoxine, sondern auch fr Ochratoxin A, Fumonisine, Deoxynivalenol und Zearalenon. Seit 2001 werden die nationalen Bestimmun-gen du
9、rch EU-weit geltende Hchstgehaltregelungen fr Kontaminanten in Lebensmitteln ergnzt. Hchs-tgehalte an Mykotoxinen in bestimmten Lebensmitteln werden auerdem noch durch verschiedene andere Verordnungen geregelt. Fr die im Inhalt zitierten Normen wird im Folgenden auf die entsprechenden Deutschen Norm
10、en hingewiesen: EN ISO 3696 siehe DIN EN ISO 3696 Nationaler Anhang NA (informativ) Literaturhinweise DIN EN ISO 3696, Wasser fr analytische Laborzwecke; Spezifikation und Prfverfahren 2 EUROPISCHE NORM EUROPEAN STANDARD NORME EUROPENNE EN 15829 Februar 2010 ICS 67.050; 67.080.10 Deutsche Fassung Le
11、bensmittel Bestimmung von Ochratoxin A in Korinthen, Rosinen, Sultaninen, gemischtem Trockenobst und getrockneten Feigen HPLC-Verfahren mit Reinigung an einer Immunoaffinittssule und Fluoreszenzdetektion Foodstuffs Determination of ochratoxin A in currants, raisins, sultanas, mixed dried fruit and d
12、ried figs HPLC method with immunoaffinity column cleanup and fluorescence detection Produits alimentaires Dosage de lochratoxine A dans les raisins de Corinthe, les raisins secs, les raisins secs de Smyrne, les mlanges de fruits secs et les figues sches Mthode CLHP avec purification sur colonne dimm
13、uno-affinit et dtection par fluorescence Diese Europische Norm wurde vom CEN am 18. Dezember 2009 angenommen. Die CEN-Mitglieder sind gehalten, die CEN/CENELEC-Geschftsordnung zu erfllen, in der die Bedingungen festgelegt sind, unter denen dieser Europischen Norm ohne jede nderung der Status einer n
14、ationalen Norm zu geben ist. Auf dem letzten Stand befindliche Listen dieser nationalen Normen mit ihren bibliographischen Angaben sind beim Management-Zentrum des CEN oder bei jedem CEN-Mitglied auf Anfrage erhltlich. Diese Europische Norm besteht in drei offiziellen Fassungen (Deutsch, Englisch, F
15、ranzsisch). Eine Fassung in einer anderen Sprache, die von einem CEN-Mitglied in eigener Verantwortung durch bersetzung in seine Landessprache gemacht und dem Management-Zentrum mitgeteilt worden ist, hat den gleichen Status wie die offiziellen Fassungen. CEN-Mitglieder sind die nationalen Normungsi
16、nstitute von Belgien, Bulgarien, Dnemark, Deutschland, Estland, Finnland, Frankreich, Griechenland, Irland, Island, Italien, Kroatien, Lettland, Litauen, Luxemburg, Malta, den Niederlanden, Norwegen, sterreich, Polen, Portugal, Rumnien, Schweden, der Schweiz, der Slowakei, Slowenien, Spanien, der Ts
17、chechischen Republik, Ungarn, dem Vereinigten Knigreich und Zypern. EUROPISCHES KOMITEE FR NORMUNG EUROPEAN COMMITTEE FOR STANDARDIZATION COMIT EUROPEN DE NORMALISATIONManagement-Zentrum: Avenue Marnix 17, B-1000 Brssel 2010 CEN Alle Rechte der Verwertung, gleich in welcher Form und in welchem Verfa
18、hren, sind weltweit den nationalen Mitgliedern von CEN vorbehalten.Ref. Nr. EN 15829:2010 DEN 15829:2010 (D) 2 Inhalt Seite Vorwort 3 1 Anwendungsbereich .4 2 Normative Verweisungen4 3 Kurzbeschreibung .4 4 Chemikalien4 5 Gerte und Hilfsmittel .7 6 Durchfhrung.8 7 HPLC-Analyse 9 8 Berechnung11 9 Prz
19、ision .11 10 Untersuchungsbericht 12 Anhang A (informativ) Typisches Chromatogramm 13 Anhang B (informativ) Przisionsdaten 14 Literaturhinweise 15 DIN EN 15829:2010-05 EN 15829:2010 (D) 3 Vorwort Dieses Dokument (EN 15829:2010) wurde vom Technischen Komitee CEN/TC 275 Lebensmittelanalytik Horizontal
20、e Verfahren“ erarbeitet, dessen Sekretariat vom DIN gehalten wird. Diese Europische Norm muss den Status einer nationalen Norm erhalten, entweder durch Verffentlichung eines identischen Textes oder durch Anerkennung bis Juli 2010, und etwaige entgegenstehende nationale Normen mssen bis Juli 2010 zur
21、ckgezogen werden. Es wird auf die Mglichkeit hingewiesen, dass einige Texte dieses Dokuments Patentrechte berhren knnen. CEN und/oder CENELEC sind nicht dafr verantwortlich, einige oder alle diesbezglichen Patentrechte zu identifizieren. Dieses Dokument wurde unter einem Mandat erarbeitet, das die E
22、uropische Kommission und die Europische Freihandelszone dem CEN erteilt haben, und untersttzt grundlegende Anforderungen der EG-Richtlinien. Entsprechend der CEN/CENELEC-Geschftsordnung sind die nationalen Normungsinstitute der folgenden Lnder gehalten, diese Europische Norm zu bernehmen: Belgien, B
23、ulgarien, Dnemark, Deutschland, Estland, Finnland, Frankreich, Griechenland, Irland, Island, Italien, Kroatien, Lettland, Litauen, Luxemburg, Malta, Niederlande, Norwegen, sterreich, Polen, Portugal, Rumnien, Schweden, Schweiz, Slowakei, Slowenien, Spanien, Tschechische Republik, Ungarn, Vereinigtes
24、 Knigreich und Zypern. DIN EN 15829:2010-05 EN 15829:2010 (D) 4 1 Anwendungsbereich Diese Europische Norm legt ein Verfahren zur Bestimmung von Ochratoxin A in Korinthen, Rosinen, Sultaninen, gemischtem Trockenobst und getrockneten Feigen durch Hochleistungsflssigchromatographie (HPLC) mit Reinigung
25、 an einer Immunoaffinittssule und Fluoreszenzdetektion fest. Dieses Verfahren wurde in einem Ringversuch durch die Untersuchung sowohl von natrlich kontaminierten als auch von aufgestockten Proben mit Gehalten von 1,1 g/kg bis 11 g/kg validiert. Weitere Informationen zur Validierung siehe Abschnitt
26、9 und Anhang B. WARNUNG Bei der Anwendung dieser Norm ist es mglich, dass gefhrliche Substanzen und Gerte angewendet bzw. gefhrliche Arbeitsgnge durchgefhrt werden. Diese Norm erhebt nicht den Anspruch, dass alle mit ihrer Anwendung verbundenen Sicherheitsprobleme angesprochen werden. Es liegt in de
27、r Verantwortung des Anwenders dieser Norm, geeignete Vorkehrungen fr den Arbeits- und Gesundheitsschutz zu treffen und vor der Anwendung die Anwendbarkeit einschrnkender Vor-schriften zu bestimmen. 2 Normative Verweisungen Die folgenden zitierten Dokumente sind fr die Anwendung dieses Dokuments erfo
28、rderlich. Bei datierten Verweisungen gilt nur die in Bezug genommene Ausgabe. Bei undatierten Verweisungen gilt die letzte Ausgabe des in Bezug genommenen Dokuments (einschlielich aller nderungen). EN ISO 3696:1995, Wasser fr analytische Laborzwecke Spezifikation und Prfverfahren (ISO 3696:1987) 3 K
29、urzbeschreibung Die Probeneinwaage wird mit einem Gemisch aus Methanol und Phosphorsure extrahiert. Der Extrakt wird filtriert, mit einer phosphatgepufferten Salzlsung verdnnt und auf eine Immunoaffinittssule aufgebracht, die spezifische Antikrper gegen Ochratoxin A enthlt. Ochratoxin A wird auf der
30、 Sule isoliert, gereinigt und konzentriert und anschlieend mit einem Elutionsmittel abgetrennt. Ochratoxin A wird durch Hochleistungs-flssigchromatographie (HPLC) an einer Umkehrphasen-Sule und Fluoreszenzdetektion quantitativ be-stimmt. 4 Chemikalien 4.1 Allgemeines Falls nicht anders festgelegt, w
31、erden nur Chemikalien von anerkannter Analysenreinheit und Wasser der Qualitt 1 nach EN ISO 3696:1995 verwendet. Die Qualitt der Lsemittel muss fr die HPLC-Analyse geeignet sein. Kommerziell erhltliche Lsungen mit gleichen Eigenschaften wie die hier aufgelisteten drfen verwendet werden. WARNUNG Die
32、Entsorgung von Lsemittelabfllen muss nach den geltenden Umweltschutzregeln und -bestimmungen erfolgen. Die Internationale Agentur fr Krebsforschung (International Agency for Research on Cancer (IARC) hat Dekontaminationshinweise fr Laborabflle herausgegeben, siehe 1. 4.2 Helium, gereinigtes Druckgas
33、 4.3 Dinatriumhydrogenphosphat, wasserfrei oder Na2HPO4 12 H2O 4.4 Kaliumchlorid 4.5 Kaliumdihydrogenphosphat DIN EN 15829:2010-05 EN 15829:2010 (D) 5 4.6 Natriumchlorid 4.7 Natriumhydroxid 4.8 Ammoniumhydroxid-Lsung, Stoffmengenkonzentration c(NH4OH) = 1,1 mol/l, zur Verschiebung des pH-Wertes fr d
34、ie Nachsulenreaktion. Die Lsung wird bei Bedarf frisch hergestellt (optional, siehe 7.2). 4.9 Salzsure-Lsung, Massenkonzentration w(HCl) = 37 % in Wasser 4.10 Phosphorsure-Lsung, c(H3PO4) = 0,1 mol/l 4.11 Salzsure-Lsung, c(HCl) = 0,1 mol/l 8,28 ml Salzsure-Lsung (4.9) werden auf 1 l mit Wasser aufge
35、fllt. 4.12 Natriumhydroxid-Lsung, c(NaOH) = 0,1 mol/l 4 g Natriumhydroxid (4.7) werden in 1 l Wasser gelst. 4.13 Phosphatgepufferte Kochsalzlsung (PBS-Puffer) 8,0 g Natriumchlorid (4.6), 1,2 g wasserfreies Dinatriumhydrogenphosphat oder 2,9 g Na2HPO4 12 H2O (4.3), 0,2 g Kaliumdihydrogenphosphat (4.5
36、) und 0,2 g Kaliumchlorid (4.4) werden in 900 ml Wasser gelst. Nach dem Lsen wird der pH-Wert mit Salzsure-Lsung (4.11) bzw. Natriumhydroxid-Lsung (4.12) auf 7,4 eingestellt; anschlieend wird die Lsung mit Wasser auf 1 l aufgefllt. Alternativ kann eine PBS-Lsung mit gleichwertigen Eigenschaften aus
37、handelsblichen PBS-Substanzen hergestellt werden. 4.14 Acetonitril WARNUNG Acetonitril ist gefhrlich, und Proben mssen mit einem explosionsgeschtzten Mixgert in einem Laborabzug gemischt werden. Nach dem Mischen mssen die Proben in dem Laborabzug filtriert werden. 4.15 Eisessig, w(CH3COOH) 98 % 4.16
38、 Methanol 4.17 Toluol 4.18 Injektionslsemittel 80 Volumenteile Wasser werden mit 20 Volumenteilen Acetonitril (4.14) und 2 Volumenteilen Eisessig (4.15) gemischt. 4.19 Mobile Phase 99 Volumenteile Wasser werden mit 99 Volumenteilen Acetonitril (4.14) und 2 Volumenteilen Eisessig (4.15) gemischt. Die
39、 mobile Phase wird zum Beispiel mit Helium (4.2) entgast. 4.20 Toluol/Eisessig-Gemisch 99 Volumenteile Toluol (4.17) werden mit 1 Volumenteil Eisessig (4.15) gemischt. DIN EN 15829:2010-05 EN 15829:2010 (D) 6 4.21 Immunoaffinittssule Die Immunoaffinittssule enthlt Antikrper gegen Ochratoxin A. Die K
40、apazitt der Sule darf nicht geringer als 100 ng Ochratoxin A sein, und die Wiederfindung darf nicht geringer als 70 % sein, wenn 5 ng Ochra-toxin A in einer Lsung aus 5 Volumenteilen Acetonitril (4.14) und 95 Volumenteilen phosphatgepufferter Kochsalzlsung (4.13) aufgebracht werden. 4.22 Oberflchen-
41、Silanisierungsflssigkeit (wahlfrei) 1 Volumenteil Oberflchen-Silanisierungsflssigkeit wird mit 19 Volumenteilen Toluol (4.17) gemischt. 4.23 Ochratoxin A, in Kristallform oder als Film in Ampullen 4.24 Ochratoxin A-Stammlsung WARNUNG Ochratoxin A ist ein starkes Nierengift mit immunotoxischen, terat
42、ogenen und poten-tiell genotoxischen Eigenschaften. Ochratoxin A wurde von der Internationalen Agentur fr Krebs-forschung (IARC) als mglicherweise krebserregend fr Menschen eingestuft (Gruppe 2B). Whrend der gesamten Untersuchung mssen Schutzbekleidung, Handschuhe und eine Sicherheitsbrille getragen
43、 werden und smtliche Schritte zur Vorbereitung von Standard- und Probenlsungen sollten in einem Laborabzug durchgefhrt werden. 1 mg Ochratoxin A oder der Inhalt von 1 Ampulle (wenn Ochratoxin A als Film erhalten wurde) wird im Lse-mittelgemisch (4.20) gelst, wobei eine Lsung erhalten wird, die etwa
44、20 g/ml bis 30 g/ml Ochratoxin A enthlt. Zur Bestimmung der genauen Konzentration wird die Absorptionskurve zwischen 300 nm und 370 nm in einer 1-cm-Quarzkvette mit einem Spektralphotometer (5.12) gegen das Lsemittelgemisch (4.20) aufgezeichnet. Die Wellenlnge bei der hchsten Absorption wird ermitte
45、lt. Die Massenkonzentration von Ochratoxin A, ota, in Mikrogramm je Milliliter, wird nach Gleichung (1) berechnet: bMA=100maxota(1) Dabei ist Amaxdie im Maximum der Absorptionskurve ermittelte Absorption (hier bei 333 nm); M die Molmasse von Ochratoxin A (M = 403,8 g/mol), in Gramm je Mol; der molar
46、e Extinktionskoeffizient von Ochratoxin A im Lsemittelgemisch (4.20) (hier: 544 m2/mol, siehe 2), in Quadratmeter je Mol; b die Schichtdicke (optische Weglnge) der Quarzkvette, in Zentimeter. Die Lsung wird bei etwa 18 C in einem Gefrierschrank aufbewahrt. Vor dem ffnen muss die Lsung Raumtemperatur
47、 erreichen. Eine so aufbewahrte Lsung ist mindestens 12 Monate haltbar; die Stabilitt muss jedoch geprft werden, wenn die Lsung lter als 6 Monate ist. 4.25 Ochratoxin A-Aufstocklsung Ein Volumenanteil der Stammlsung (4.24), der 12,5 g Ochratoxin A enthlt, wird in einen 5-ml-Messkolben berfhrt und be
48、i hchstens 50 C unter einem Stickstoffstrom bis zur Trockne eingedampft. Der Rckstand wird sofort erneut in Methanol (4.16) aufgenommen und die Lsung bis zur Marke mit Methanol aufgefllt. Diese Lsung enthlt 2,5 g/ml Ochratoxin A. Die Lsung wird bei etwa 18 C in einem Gefrierschrank aufbewahrt. Vor d
49、em ffnen muss die Lsung Raumtemperatur erreichen. Eine so aufbewahrte Lsung ist mindestens 12 Monate haltbar; die Stabilitt muss jedoch geprft werden, wenn die Lsung lter als 6 Monate ist. DIN EN 15829:2010-05 EN 15829:2010 (D) 7 4.26 Ochratoxin A-Standardlsung 500 l Ochratoxin A-Aufstocklsung (4.25) w
