1、DEUTSCHE NORMEN ISO 16654 DIN Deutsches Institut fr Normung e. V. Jede Art der Vervielfltigung, auch auszugsweise,nur mit Genehmigung des DIN Deutsches Institut fr Normung e. V., Berlin, gestattet.Alleinverkauf der Normen durch Beuth Verlag GmbH, 10772 BerlinICS 07.100.30Microbiology of food and ani
2、mal feeding stuffs Horizontal method forthe detection of Escherichia coli O157 (ISO 16654:2001);German version EN ISO 16654:2001Microbiologie des aliments Mthode horizontale pour la recherchedes Escherichia coli O157 (ISO 16654:2001);Version allemande EN ISO 16654:2001Die Europische Norm EN ISO 1665
3、4:2001 hat den Status einer Deutschen Norm.Nationales VorwortDiese Europische Norm enthlt unverndert die Internationale Norm ISO 16654, die vom SC 9 Mikro-biologie von Lebensmitteln und Futtermitteln“ (Sekretariat: Frankreich) des Technischen Komitees ISO/TC 34Landwirtschaftliche Lebensmittelerzeugn
4、isse“ (Sekretariat: Ungarn) erarbeitet wurde. Aufgrund der Ergebnisseder parallelen Abstimmung im Rahmen der Wiener Vereinbarung ist diese Norm ebenso als EuropischeNorm EN ISO 16654:2001erschienen.Die Mitarbeit des DIN im SC 9 des ISO/TC 34 und in der Arbeitsgruppe 6 des CEN/TC 275 wird ber denArbe
5、itsausschuss Mikrobiologische Lebensmitteluntersuchung einschlielich Schnellverfahren“ des Normen-ausschusses Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL) wahrgenommen.Fr die im Abschnitt 2 zitierten Internationalen Normen wird im Folgenden auf die entsprechendenDeutschen Normen hingewiesen:I
6、SO 6887-1 siehe DIN EN ISO 6887-1.nderungenGegenber DIN 10167:1998-12 wurden folgende nderungen vorgenommen:a) Normnummer gendert.b) Titel gendert.c) Der Anwendungsbereich wurde von Fleisch und Fleischerzeugnissen auf alle Lebensmittel und Futter-mittel erweitert.d) Als Anreicherungsmedium steht nur
7、 die modifizierte Trypton-Soja-Bouillon mit Novobiocin (mTSB + N)zur Verfgung. Die Verwendung von Brillantgrn-Galle-Lactose-Bouillon (BRILA) ist nicht mehr vorgesehen.e) Als selektives Nhrmedium fr die Subkultivierung wird der Cefixim-Tellurit-Sorbit-MacConkey-Nhr-boden (CT-SMAC) verwendet, die Wahl
8、 des zweiten selektiven Nhrmediums fr die Subkultivierung istfreigestellt.Frhere AusgabenDIN 10167: 1998-07, 1998-12November 2001Fortsetzung Seite 2und 14 Seiten ENNormenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL)im DIN Deutsches Institut fr Normung e.V.Mikrobiologie von Lebensmitt
9、eln und FuttermittelnHorizontales Verfahren fr den Nachweis vonEscherichia coli O157(ISO 16654:2001) Deutsche Fassung EN ISO 16654:2001Ref. Nr. DIN EN ISO 16654:2001-11Preisgr. 12 Vertr.-Nr. 2312teilweise Ersatz frDIN 10167:1998-12DIN EN ISO 16654:2001-11 (D)2Nationaler Anhang NA(informativ)Literatu
10、rhinweiseDIN EN ISO 6887-1, Mikrobiologie von Lebensmitteln und Futtermitteln Vorbereitung von Untersuchungs-proben und Herstellung von Erstverdnnungen und von Dezimalverdnnungen fr mikrobiologische Unter-suchungen Teil 1: Allgemeine Regeln fr die Herstellung von Erstverdnnungen und Dezimalverdnnung
11、en(ISO 6887-1:1999); Deutsche Fassung EN ISO 6887-1:1999.EUROPISCHES KOMITEE FR NORMUNGEUROPEAN COMMITTEE FOR STANDARDIZATIONCOMIT EUROPEN DE NORMALISATIONManagement-Zentrum: rue de Stassart, 36 B-1050 BrsselprErsatz fr 2001 CEN Alle Rechte der Verwertung, gleich in welcher Form und in welchem Verfa
12、hren,sind weltweit den nationalen Mitgliedern von CEN vorbehalten.ENTWURFEN ISO 16654Microbiology of food and animal feeding stuffs Horizontal method for the detection ofEscherichia coli O157(ISO 16654:2001)Microbiologie des aliments Mthode horizontale pour la recherche desEscherichia coli O157(ISO
13、16654:2001)Diese Europische Norm wurde von CEN am 1. Mai 2001 angenommen.Die CEN-Mitglieder sind gehalten, die CEN/CENELEC-Geschftsordnung zu erfllen, in der die Bedingungenfestgelegt sind, unter denen dieser Europischen Norm ohne jede nderung der Status einer nationalen Norm zugeben ist.Auf dem let
14、zten Stand befindliche Listen dieser nationalen Normen mit ihren bibliographischen Angaben sind beimManagement-Zentrum oder bei jedem CEN-Mitglied auf Anfrage erhltlich.Diese Europische Norm besteht in drei offiziellen Fassungen (Deutsch, Englisch, Franzsisch). Eine Fassung in eineranderen Sprache,
15、die von einem CEN-Mitglied in eigener Verantwortung durch bersetzung in seine Landessprachegemacht und dem Management-Zentrum mitgeteilt worden ist, hat den gleichen Status wie die offiziellen Fassungen.CEN-Mitglieder sind die nationalen Normungsinstitute von Belgien, Dnemark, Deutschland, Finnland,
16、 Frankreich,Griechenland, Irland, Island, Italien, Luxemburg, Niederlande, Norwegen, sterreich, Portugal, Schweden, Schweiz,Spanien, der Tschechischen Republik und dem Vereinigten Knigreich.Ref. Nr. EN ISO 16654:2001 DMai 2001ICS 07.100.30Deutsche FassungMikrobiologie von Lebensmitteln und Futtermit
17、telnHorizontales Verfahren fr den Nachweis vonEscherichia coli O157(ISO 16654:2001)EN ISO 16654:2001 (D)2InhaltSeiteVorwor t . 3Einleitung . 31 Anwendungsbereich . 42 Normative Verweisungen 43Begrife . 44 Kurzbeschreibung 45 Nhrmedien, Chemikalien und Antiseren . 46 Gerte und Hilfsmittel 97 Probenah
18、me 98 Vorbereitung der Untersuchungsprobe 109 Durchfhrung (siehe Anhang A) . . . 109.1 Einwaage und Erstverdnnung .109.2 Anreicherung .109.3 Immunomagnetische Separation (IMS) 109.4 Beimpfen von Selektivnhrbden und Identifizierung von E. coli O157 . 119.5 Besttigung 119.6 Weitere Differenzierung .12
19、10 Qualittssicherung .1210.1 Prfstmme fr die Qualittssicherung . . . .1210.2 Kulturverfahren .1211 Angabe der Ergebnisse 1212 Untersuchungsbericht .12Anhang A (normativ) Verfahrensdiagramm 13Literaturhinweise .14Anhang ZA (normativ) Normative Verweisungen auf internationalePublikationen mit ihren en
20、tsprechenden europischen Publikationen . . . 14EN ISO 16654:2001 (D)3VorwortDer Text der Internationalen Norm ISO 16654:2001 wurde vom Technischen Komitee ISO/TC 34 Agriculturalfood products“ in Zusammenarbeit mit dem Technischen Komitee CEN/TC 275 Lebensmittelanalytik Horizontale Verfahren“ erarbei
21、tet, dessen Sekretariat vom DIN gehalten wird.Diese Europische Norm muss den Status einer nationalen Norm erhalten, entweder durch Verffentlichungeines identischen Textes oder durch Anerkennung bis November 2001, und etwaige entgegenstehendenationale Normen mssen bis November 2001 zurckgezogen werde
22、n.Entsprechend der CEN/CENELEC-Geschftsordnung sind die nationalen Normungsinstitute der folgendenLnder gehalten, diese Europische Norm zu bernehmen:Belgien, Dnemark, Deutschland, Finnland, Frankreich, Griechenland, Irland, Italien, Luxemburg, Niederlande,Norwegen, sterreich, Portugal, Schweden, Sch
23、weiz, Spanien, die Tschechische Republik und das VereinigteKnigreich.Der Anhang A ist normativ.AnerkennungsnotizDer Text der Internationalen Norm ISO 16654:2001 wurde von CEN als Europische Norm ohne irgendeineAbnderung genehmigt.ANMERKUNG Die normativen Verweisungen auf Internationale Normen sind i
24、m Anhang ZA (normativ) aufgefhrt.EinleitungWegen der Vielzahl von Produkten innerhalb dieses Anwendungsbereiches kann dieses horizontale Verfahrennicht bis ins Einzelne fr bestimmte Produkte geeignet sein. In diesem Fall drfen unterschiedliche Verfahren,die speziell auf diese Produkte zutreffen, ang
25、ewendet werden, wenn dies aus fachlichen Grnden absolutnotwendig ist. Dennoch sollte stets versucht werden, den vorgegebenen Regeln so weit wie mglich zu folgen.Bei der nchsten berarbeitung dieser Internationalen Norm werden smtliche dann zur Verfgung stehendenInformationen ber die Akzeptanz dieser
26、Norm und die Grnde fr Abweichungen bei einzelnen Produktenbercksichtigt werden.Die Harmonisierung der Untersuchungsverfahren kann nicht sofort erfolgen. Fr bestimmte Produktgruppenknnen bereits internationale Normen und/oder nationale Normen bestehen, die diesem horizontalen Ver-fahren nicht entspre
27、chen. Es ist jedoch anzustreben, sie bei einer berarbeitung an diese Internationale Normanzupassen, so dass es sich bei den noch verbleibenden Abweichungen nur um solche handelt, die fachlichbegrndet sind.WARNHINWEIS: Escherichia coli O157 kann schwere, lebensgefhrliche Krankheiten verursachen, fr d
28、erenAuslsung nur eine geringe Dosis erforderlich ist. Von Laborinfektionen ist berichtet worden.Um die Gesundheit des Laborpersonals sicherzustellen, ist es unerlsslich, dass das gesamte Verfahrenausschlielich von geschultem Personal nach der guten Laborpraxis und vorzugsweise an einem geeigneten Or
29、tdurchgefhrt wird. Die entsprechenden nationalen Gesundheits- und Sicherheitsbestimmungen im Hinblick aufdiesen Organismus sind einzuhalten.Alles infektise Material muss unter Beachtung der notwendigen Vorsichtsmanahmen entsorgt werden.EN ISO 16654:2001 (D)41 AnwendungsbereichDiese Internationale No
30、rm legt ein horizontales Verfahren zum Nachweis von Escherichia coli (E. coli) SerogruppeO157 fest.Vorbehaltlich der in der Einleitung angefhrten Einschrnkungen ist diese Internationale Norm auf Lebensmittelund Futtermittel anwendbar.2 Normative VerweisungenDie folgenden normativen Dokumente enthalt
31、en Festlegungen, die durch Verweisung in diesem Text Bestandteildieser Internationalen Norm sind. Bei datierten Verweisungen gelten sptere nderungen oder berarbeitungendieser Publikationen nicht. Anwender dieser Internationalen Norm werden jedoch gebeten, die Mglichkeit zuprfen, die jeweils neuesten
32、 Ausgaben der nachfolgend angegebenen normativen Dokumente anzuwenden.Bei undatierten Verweisungen gilt die letzte Ausgabe des in Bezug genommenen normativen Dokuments.Mitglieder von ISO und IEC fhren Verzeichnisse der gltigen Internationalen Normen.ISO 6887-1, Microbiology of food and animal feedin
33、g stuffs Preparation of test samples, initial suspensionand decimal dilutions for microbiological examination Part 1: General rules for the preparation of the initialsuspension and decimal dilutions.ISO 7218, Microbiology of food and animal feeding stuffs General rules for microbiological examinatio
34、ns.3BegrifeFr die Anwendung dieser Internationalen Norm gilt der folgende Begriff:3.1Escherichia coli O157E. coli O157Mikroorganismen, die auf der Oberflche eines Nhrbodens nach dieser Internationalen Norm typischeKolonien bilden, Indol bilden und mit Antiserum gegen O157-Antigen agglutinierenANMERK
35、UNG 1 Sorbit-positive E. coli O157-Stmme werden nicht mit CT-SMAC-Medium (5.2) erfasst.ANMERKUNG 2 Auf eine Indol-negative Mutation wird hingewiesen.4 KurzbeschreibungDer Nachweis von Escherichia coli O157 erfordert vier aufeinander folgende Bearbeitungsschritte (sieheAnhang A).a) Anreicherung der h
36、omogenisierten Einwaage in modifizierter Trypton-Soja-Bouillon mit Novobiocin(mTSB + N) durch 6h und danach weiteren 12 h bis 18 h Bebrtung bei 41,5 C 1 C.b) Separation und Konzentration der Mikroogranismen mit immunomagnetischen Partikeln, die mit E. coliO157-Antikrpern beschickt sind.c) Isolierung
37、 durch Subkultivierung der immunomagnetischen Partikel mit anhaftenden Keimen auf demCefixim-Tellurit-Sorbit-MacConkey-Nhrboden (CT-SMAC-Nhrboden) und einem weiteren selektivenIsolationsmedium nach Wahl des Anwenders.d) Besttigung der fr E. coli O157 typischen, sorbit-negativen Kolonien auf CT-SMAC
38、und der fr E. coliO157 typischen Kolonien auf dem zweiten Isolationsmedium durch Prfung auf Indol-Produktion undAgglutination mit E. coli O157-Antiserum.ANMERKUNG Weitere Differenzierungsschritte, z. B. durch Pathogenittsfaktoren, knnen durchgefhrt werden, indemdie positiven Isolate an ein Referenzl
39、abor gegeben werden.5 Nhrmedien, Chemikalien und AntiserenZur allgemeinen Laborpraxis, siehe ISO 7218.5.1 Anreicherungsmedium: Modifizierte Trypton-Soja-Bouillon mit Novobiocin (mTSB + N)Siehe 1.EN ISO 16654:2001 (D)55.1.1 Modifizierte Trypton-Soja-Bouillon (mTSB)5.1.1.1 Zusammensetzung5.1.1.2 Herst
40、ellungDie Bestandteile oder das getrocknete vollstndige Medium werden im Wasser gelst, falls erforderlich unterErwrmen.Der pH-Wert wird, falls erforderlich, mit dem pH-Messgert (6.6) so eingestellt, dass er bei 25 C nach demSterilisieren pH = 7,4 0,2 betrgt.Das Medium wird in angemessenen Anteilen i
41、n Kolben oder Flaschen (6.7) gefllt.Das Medium wird 15 min im Autoklaven (6.1) bei 121 C sterilisiert.5.1.2 Novobiocin-Lsung5.1.2.1 Zusammensetzung5.1.2.2 HerstellungDas Novobiocin wird im Wasser gelst und durch Membranfiltration sterilisiert.Die Lsung wird am Verwendungstag hergestellt.5.1.2.3 Hers
42、tellung des vollstndigen MediumsUnmittelbar vor der Verwendung werden entweder 1ml oder 4ml Novobiocin-Lsung (5.1.2) zu entweder225 ml oder 900 ml abgekhlter mTSB (5.1.1) gegeben.Die resultierende Konzentration an Novobiocin betrgt 20 mg/l mTSB.5.2 Erstes selektives Nhrmedium fr die Subkultivierung:
43、Cefixim-Tellurit-Sorbit-MacConkey-Nhrboden (CT-SMAC)Siehe 2.5.2.1 Grundmedium5.2.1.1 ZusammensetzungCasein, enzymatisch verdaut 17,0 gSoja, enzymatisch verdaut 3,0 gD(+)-Glucose 2,5 gGallensalze Nr. 3 1,5 gNatriumchlorid 5,0 gdi-Kaliumhydrogenphosphat (K2HPO4) 4,0 gWasser 1 000 mlNovobiocin 0,45 gWa
44、sser 100 mlCasein, enzymatisch verdaut 17,0 gatierisches Gewebe, enzymatisch verdaut 3,0 gaSorbit 10,0 gaGallensalze Nr. 3 1,5 gaNatriumchlorid 5,0 gaNeutralrot 0,03 gaKristallviolett 0,001 gaAgar 9 g bis 18 gaWasser 1 000 mlaa je nach GeliereigenschaftenEN ISO 16654:2001 (D)65.2.1.2 HerstellungDie
45、Grundbestandteile oder das vollstndige getrocknete Grundmedium werden im Wasser durch Siedengelst.Der pH-Wert wird, falls erforderlich, so eingestellt (6.6), dass er bei 25 C nach dem Sterilisieren pH = 7,1 0,2betrgt.Das Medium wird 15 min in einem Autoklaven (6.1) bei 121 C sterilisiert.5.2.2 Kaliu
46、mtellurit-Lsung5.2.2.1 Zusammensetzung5.2.2.2 HerstellungDas Kaliumtellurit wird im Wasser gelst und anschlieend durch Membranfiltration sterilisiert.Die Kaliumtellurit-Lsung darf bei Raumtemperatur bis zu einem Monat aufbewahrt werden, muss aber beiAuftreten eines weien Niederschlages verworfen wer
47、den.5.2.3 Cefixim-Lsung5.2.3.1 Zusammensetzung5.2.3.2 HerstellungDas Cefixim wird im Wasser gelst und durch Membranfiltration sterilisiert.ANMERKUNG Es kann notwendig sein, Cefixim in Ethanol zu lsen.Die Lsung darf bei 3 C 2 C eine Woche aufbewahrt werden.5.2.4 Vollstndiges Medium5.2.4.1 Zusammenset
48、zung5.2.4.2 HerstellungEntweder wird das gerade sterilisierte Grundmedium (5.2.1) auf 44C bis 47C abgekhlt (6.5), oder das bereitsvorher sterilisierte und verfestigte Grundmedium wird durch Dampf geschmolzen und dann auf 44 C bis 47 Cabgekhlt.1ml Tellurit-Lsung und 1ml Cefixim-Lsung werden zu 1 000
49、ml Grundmedium gegeben, gemischt und inetwa 15-ml-Anteilen in sterile Petrischalen (6.15) gegeben.Das Medium wird zum Verfestigen stehengelassen.Die resultierende Konzentration an Tellurit betrgt 2,5 mg/l und an Cefixim 0,05 mg/l.Direkt vor der Verwendung werden die Agarplatten getrocknet; vorzugsweise ohne Deckel und mit der Agar-oberflche nach unten. Die Trocknung erfolgt im Br
