1、 DEUTSCHE NORM September 2006DIN EN ISO 17375 ICS 65.120 Futtermittel Bestimmung von Aflatoxin B1(ISO 17375:2006); Deutsche Fassung EN ISO 17375:2006 Animal feeding stuffs Determination of aflatoxin B1(ISO 17375:2006); German version EN ISO 17375:2006 Aliments des animaux Dosage de laflatoxine B1(IS
2、O 17375:2006); Version allemande EN ISO 17375:2006 Gesamtumfang 16 SeitenNormenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL) im DIN DIN Deutsches Institut fr Normung e.V. .Jede Art der Vervielfltigung, auch auszugsweise, nur mit Genehmigung des DIN Deutsches Institut fr Normung e.V.,
3、 Berlin gestattet. Alleinverkauf der Normen durch Beuth Verlag GmbH, 10772 Berlin Preisgruppe 11 www.din.de www.beuth.de !,j/“9715912DIN EN ISO 17375:2006-09 2 Nationales Vorwort Diese Europische Norm enthlt unverndert die Internationale Norm ISO 17375:2006, die vom Unterkomitee SC 10 Futtermittel“
4、(Sekretariat: NEN, Niederlande) des Technischen Komitees ISO/TC 34 Lebensmittelprodukte“ (Sekretariat: MSZT, Ungarn) erarbeitet wurde. Auf Grund des Beschlusses des CEN/TC 327 wurde die Bearbeitung im parallelen Abstimmungsverfahren unter Federfhrung des ISO/SC 10 durchgefhrt. Die Mitarbeit des DIN
5、beim Europischen Komitee fr Normung (CEN) wird fr den Bereich des CEN/TC 327 Futtermittel Probenahme- und Untersuchungsverfahren“ (Sekretariat: NEN, Niederlande) ber das nationale Spiegelgremium, den Arbeitsausschuss Futtermittel“ des Normenausschusses Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (
6、NAL) wahrgenommen. Fr die in diesem Dokument zitierte Internationale Norm wird im Folgenden auf die entsprechende Deutsche Norm hingewiesen: ISO 3696 siehe DIN ISO 3696 Nationaler Anhang NA (informativ) Literaturhinweise DIN ISO 3696, Wasser fr analytische Zwecke Anforderungen und Prfungen EUROPISCH
7、E NORM EUROPEAN STANDARD NORME EUROPENNE EN ISO 17375 Juni 2006 ICS 65.120 Deutsche Fassung Futtermittel Bestimmung von Aflatoxin B1(ISO 17375:2006) Animal feeding stuffs Determination of aflatoxin B1(ISO 17375:2006) Aliments des animaux Dosage de laflatoxine B1(ISO 17375:2006) Diese Europische Norm
8、 wurde vom CEN am 12. Mai 2006 angenommen. Die CEN-Mitglieder sind gehalten, die CEN/CENELEC-Geschftsordnung zu erfllen, in der die Bedingungen festgelegt sind, unter denen dieser Europischen Norm ohne jede nderung der Status einer nationalen Norm zu geben ist. Auf dem letzten Stand befindliche List
9、endieser nationalen Normen mit ihren bibliographischen Angaben sind beim Management-Zentrum oder bei jedem CEN-Mitglied auf Anfrage erhltlich. Diese Europische Norm besteht in drei offiziellen Fassungen (Deutsch, Englisch, Franzsisch). Eine Fassung in einer anderen Sprache,die von einem CEN-Mitglied
10、 in eigener Verantwortung durch bersetzung in seine Landessprache gemacht und dem Management-Zentrum mitgeteilt worden ist, hat den gleichen Status wie die offiziellen Fassungen. CEN-Mitglieder sind die nationalen Normungsinstitute von Belgien, Dnemark, Deutschland, Estland, Finnland, Frankreich, Gr
11、iechenland,Irland, Island, Italien, Lettland, Litauen, Luxemburg, Malta, den Niederlanden, Norwegen, sterreich, Polen, Portugal, Rumnien,Schweden, der Schweiz, der Slowakei, Slowenien, Spanien, der Tschechischen Republik, Ungarn, dem Vereinigten Knigreich und Zypern.EUROPISCHES KOMITEE FR NORMUNG EU
12、ROPEAN COMMITTEE FOR STANDARDIZATION COMIT EUROPEN DE NORMALISATIONManagement-Zentrum: rue de Stassart, 36 B-1050 Brssel 2006 CEN Alle Rechte der Verwertung, gleich in welcher Form und in welchem Verfahren, sind weltweit den nationalen Mitgliedern von CEN vorbehalten.Ref. Nr. EN ISO 17375:2006 DEN I
13、SO 17375:2006 (D) 2 Inhalt Seite Vorwort 3 1 Anwendungsbereich .4 2 Normative Verweisungen4 3 Kurzbeschreibung .4 4 Reagenzien.4 5 Gerte7 6 Durchfhrung.9 6.1 Konditionierung der IACs .9 6.2 Extraktion .9 6.3 Reinigung mittels Immunoaffinitt.9 6.4 Nachsulenderivatisierung 10 6.5 Kalibrierkurve 10 6.6
14、 Berechnung. 11 6.7 Aufstockungsverfahren zur Bestimmung der Wiederfindung . 11 7 Przision 11 7.1 Ringversuch 11 7.2 Wiederholprzision. 12 7.3 Vergleichprzision 12 8 Untersuchungsbericht . 12 Anhang A (informativ) Ergebnisse eines Ringversuchs 13 Literaturhinweise . 14 EN ISO 17375:2006 (D) 3 Vorwor
15、t Dieses Dokument (EN ISO 17375:2006) wurde vom Technischen Komitee ISO/TC 34 Food products“ in Zusammenarbeit mit dem Technischen Komitee CEN/TC 327 Futtermittel Probenahme und Untersuchungsverfahren“ erarbeitet, dessen Sekretariat vom NEN gehalten wird. Diese Europische Norm muss den Status einer
16、nationalen Norm erhalten, entweder durch Verffentlichung eines identischen Textes oder durch Anerkennung bis Dezember 2006, und etwaige entgegenstehende nationale Normen mssen bis Detember 2006 zurckgezogen werden. Entsprechend der CEN/CENELEC-Geschftsordnung sind die nationalen Normungsinstitute de
17、r folgenden Lnder gehalten, diese Europische Norm zu bernehmen: Belgien, Dnemark, Deutschland, Estland, Finnland, Frankreich, Griechenland, Irland, Island, Italien, Lettland, Litauen, Luxemburg, Malta, Niederlande, Norwegen, sterreich, Polen, Portugal, Rumnien, Schweden, Schweiz, Slowakei, Slowenien
18、, Spanien, Tschechische Republik, Ungarn, Vereinigtes Knigreich und Zypern. Anerkennungsnotiz Der Text von ISO 17375:2006 wurde vom CEN als EN ISO 17375:2006 ohne irgendeine Abnderung genehmigt. EN ISO 17375:2006 (D) 4 1 Anwendungsbereich Diese Internationale Norm legt ein Verfahren zur Bestimmung v
19、on Aflatoxin B1in Futtermitteln mittels Hochleistungs-Flssigchromatographie mit Nachsulenderivatisierung fest. Das Verfahren ist anwendbar fr Futtermittel mit einem Fettgehalt bis zu 50 %. Die quantitative Nachweisgrenze dieses Verfahrens wurde bei einem Signal-Rausch-Verhltnis von 6 fr Aflatoxin B1
20、als besser als 0,5 g/kg nachgewiesen. ANMERKUNG Das Verfahren basiert auf dem in der Literaturstelle 1 angegebenen Verfahren. 2 Normative Verweisungen Die folgenden zitierten Dokumente sind fr die Anwendung dieses Dokuments erforderlich. Bei datierten Verweisungen gilt nur die in Bezug genommene Aus
21、gabe. Bei undatierten Verweisungen gilt die letzte Ausgabe des in Bezug genommenen Dokuments (einschlielich aller nderungen). ISO 3696:1987, Water for analytical laboratory use Specification and test methods 3 Kurzbeschreibung Eine Untersuchungsmenge wird mit einer Lsemittellsung (Aceton/Wasser) ext
22、rahiert. Der Probenextrakt wird filtriert, mit Wasser oder phosphatgepufferter Kochsalzlsung (PBS) auf eine festgelegte Lsemittel-konzentration verdnnt. Ein Anteil wird auf eine Immunoaffinittssule (IAC) gegeben, die fr Aflatoxin B1spezifische Antikrper enthlt. Das Aflatoxin B1wird mit reinem Methan
23、ol von der IAC eluiert und dann durch Umkehrphasen-Hochleistungs-Flssigchromatographie (RP-HPLC) mit Nachsulenderivatisierung (PCD) mit Brom quantitativ bestimmt. Die PCD erfolgt entweder mit elektrochemisch erzeugtem Brom oder mit Pyridinhydrobromid-Perbromid (PBPB), es folgt die Fluoreszenzdetekti
24、on. 4 Reagenzien Falls nicht anders festgelegt, sind nur Reagenzien von anerkannter Analysenreinheit zu verwenden. WARNUNG Das Verfahren erfordert die Verwendung giftiger, entzndlicher Flssigkeiten wie Aceton, Methanol und Acetonitril. Der Kontakt zu diesen ist zu vermeiden und sie sind von Hitzeque
25、llen, Funken oder offenem Feuer entfernt zu halten. ANMERKUNG Dekontaminationsverfahren fr Laboratoriumsabflle 2, 3 sind durch die Internationale Agentur fr Krebsforschung (WHO) entwickelt und validiert worden. 4.1 Wasser, Qualitt 3 nach ISO 3696:1987. 4.2 Phosphatgepufferte Kochsalzlsung (PBS), pH
26、7,4 PBS darf aus Kaliumchlorid (0,20 g), Kaliumdihydrogenphosphat (0,20 g), wasserfreiem Dinatriumhydrogen-phosphat (1,16 g) oder Dinatriumhydrogenphosphat Dodecahydrat (2,92 g) und Natriumchlorid (8,00 g) hergestellt werden, die zu 900 ml gereinigtem Wasser gegeben werden. Der pH-Wert ist auf 7,4 e
27、inzustellen (je nach Fall mit HCl 0,1 mol/l oder NaOH 0,1 mol/l) und die Lsung auf 1,0 l aufzufllen. Alternativ drfen handelsblich erhltliche Tabletten fr phosphatgepufferte Kochsalzlsung mit gleich-wertigen Eigenschaften verwendet werden. PBS ist mikrobiologisch nicht stabil und sollte mindestens e
28、inmal wchentlich frisch zubereitet werden. EN ISO 17375:2006 (D) 5 4.3 Pyridinhydrobromid-Perbromid (PBPB, CAS: 39416-48-3) Dieses Reagenz ist im Fall der Verwendung von elektrochemisch erzeugtem Brom nicht erforderlich.4.4 Kaliumbromid Im Fall der Verwendung des PBPB-Reagenz ist dieses Reagenz nich
29、t erforderlich. 4.5 Acetonitril vom Reinheitsgrad fr HPLC 4.6 Methanol vom Reinheitsgrad fr HPLC 4.7 Aceton, rein 4.8 Wasser vom Reinheitsgrad fr HPLC, entsprechend der Qualitt 1 nach ISO 3696:1987 4.9 Extraktionslsemittel, Lsung aus Aceton (4.7) und Wasser (4.8) 85 + 15 Volumenteile 4.10 Salpetersu
30、re, c(NHO3) = 4 mol/l Dieses Reagenz ist im Fall der Verwendung des PBPB-Reagenz nicht erforderlich. 4.11 Immunoaffinittssule (IAC) Die IAC sollte gegen Aflatoxin B1wirksame Antikrper enthalten. Die IAC sollte eine Mindestkapazitt von 40 ng Aflatoxin B1und eine Wiederfindungsrate von mindestens 80 %
31、 fr Aflatoxin B1aufweisen, wenn dieses als Standardlsung in Aceton/Wasser mit einem Gehalt von 0,25 ng ber die Sule gegeben wird. 4.12 Lsemittel A fr die mobile Phase der HPLC, nur zur Verwendung mit dem Nachsulenreagenz PBPB. Eine Lsung aus Wasser (4.8)/Acetonitril (4.5)/Methanol (4.6) 6 + 2 + 3 Vo
32、lumenteile. Das Verhltnis der Lsemittel darf angepasst werden, um optimale Trennungsparameter bereitzustellen. 4.13 Lsemittel B fr die mobile Phase der HPLC, nur zur Verwendung mit elektrochemisch erzeugtem Brom. Eine Lsung aus Wasser (4.8)/Acetonitril (4.5)/Methanol (4.6) 6 + 2 + 3 Volumenteile, da
33、s je Liter der mobilen Phase 120 mg Kaliumbromid (4.4) und 350 l Salpetersure 4 mol/l (4.10) enthlt. Das Verhltnis der Lsemittel darf angepasst werden, um optimale Trennungsparameter bereitzustellen. Die Lsemittel fr die mobile Phase (4.12 und 4.13) sollten entgast sein. 4.14 Reagenz zur Nachsulende
34、rivatisierung, nur zur Verwendung mit dem PBPB-Nachsulenreagenz. 25 mg PBPB (4.3) werden in 500 ml Wasser gelst. Die Lsung darf bis zu 4 Tagen verwendet werden, wenn sie im Dunkeln bei Raumtemperatur gelagert wird. Dieses Nachsulenreagenz ist nur in Verbindung mit dem Lsemittel A fr die mobile Phase
35、 der HPLC (4.12) zu verwenden, jedoch nicht mit dem Lsemittel B fr die mobile Phase der HPLC (4.13). ANMERKUNG Das Nachsulenreagenz ist nur 3 Tage stabil. EN ISO 17375:2006 (D) 6 4.15 Toluol-Acetonitril-Gemisch, 98 + 2 Volumenteile 4.16 Aflatoxin B1-Standardsubstanz, fr analytische Zwecke in Form vo
36、n Kristallen oder eines trockenen Films. WARNUNG 1 Dieses Verfahren erfordert die Verwendung von Lsungen von Aflatoxin B1. Aflatoxine sind fr Menschen karzinogen. Zu beachten ist die Stellungnahme der Internationalen Agentur fr Krebsforschung (WHO) 2. WARNUNG 2 Aflatoxine unterliegen leicht der Zers
37、etzung. Die analytischen Arbeiten sind ausreichend vor Tageslicht zu schtzen, und die Aflatoxin-Standardlsungen sind durch Verwendung von Braunglasflaschen oder Aluminiumfolie gegen Licht zu schtzen. 4.17 Kalibrier-Stammlsungen fr die HPLC 4.17.1 Allgemeine Stammlsungen Es wird in Toluol-Acetonitril
38、-Gemisch (4.15) eine Stammlsung von Aflatoxin B1(4.16) mit einem Gehalt von 10,0 g/ml hergestellt. ANMERKUNG Die Toluol-Acetonitril-Stammlsung ist mindestens ein Jahr stabil, vorausgesetzt, dass sie in mit suregewaschenen Glaswaren und im Dunkeln bei 18 C gelagert wird. Falls die Stammlsungen in ein
39、er viel krzeren Zeit aufgebraucht werden (Maximum von 3 Monaten), darf als Alternative Methanol (4.6) verwendet werden. Es ist zu beachten, dass Methanollsungen empflindlicher auf eine alkalihaltige Umgebung der Glasoberflche und auf Tageslicht reagieren als die Toluol-Acetonitril-Lsungen. Die Glask
40、olben werden straff in Aluminiumfolie eingewickelt und bei einer Temperatur unter 4 C gelagert. Um die exakte Aflatoxinkonzentration dieser Stammlsung zu bestimmen, wird die Absorptionskurve zwischen den Wellenlngen 330 nm und 370 nm in 1-cm-Quarzglas-Kvetten (5.21) in einem Spektrometer (5.20) mit
41、dem Lsungsmittel der Stammlsung in der Referenzkvette aufgezeichnet. Es wird die Massenkonzentration jedes Aflatoxins, ca, in Mikrogramm je Milliliter mit der Gleichung (1) berechnet: dMAc=aamaxa100(1) Dabei ist Amaxdas Absorptionsvermgen, das beim Maximum der Absorptionskurve bestimmt wurde; Madie
42、Molmasse von Aflatoxin B1, in Gramm je Mol (312 g/mol); adas molare Absorptionsvermgen von Aflatoxin B1, in Quadratmeter je Mol (1 930 m2/mol fr Toluol-Acetonitril und 2 150 m2/mol fr Methanollsungen); d die optische Kantenlnge der Kvette, in Zentimeter. 4.17.2 Kalibrier-Stammlsungen Es wird entwede
43、r in Toluol-Acetonitril-Gemisch (4.15) oder in Methanol (4.6) von der Stammlsung (4.17.1) eine Kalibierlsung von Aflatoxin B1(4.16) mit einem Gehalt von 50,0 ng/ml hergestellt. 4.17.3 Option A (siehe 6.3) Von der Kalibrier-Stammlsung (4.17.2) werden die in der Tabelle 1 aufgefhrten Volumen (Option A
44、) in einen Satz von kalibrierten 20-ml-Messkolben pipettiert. Unter einem Stickstoffstrom wird das Toluol-Acetonitril-Gemisch bei Raumtemperatur gerade zur Trockne abgedampft. Wenn bei der Vorbereitung der Stammlsung Methanol verwendet wird, ist das Eindampfen nicht erforderlich. In jeden Kolben wer
45、den 7 ml Methanol gegeben. Die Aflatoxine werden in Lsung gebracht, dann wird diese mit Wasser bis zur Marke verdnnt und gut durchgeschttelt. EN ISO 17375:2006 (D) 7 ANMERKUNG Es ist daran zu denken, dass sich das Volumen von Methanol und Wasser beim Mischen zusammenzieht. 4.17.4 Option B (siehe 6.3
46、) Von dieser Kalibrier-Stammlsung (4.17.2) werden die in Tabelle 1 aufgefhrten Volumen (Option B) in einen Satz von mindestens 5 verschieden kalibrierten 20-ml-Messkolben pipettiert. Unter einem Stickstoffstrom wird das Toluol-Acetonitril-Gemisch bei Raumtemperatur gerade zur Trockne abgedampft. Wen
47、n bei der Vorbereitung der Stammlsung Methanol verwendet wird, ist das Eindampfen nicht erforderlich. In jeden Kolben werden etwa 10 ml Methanol gegeben. Die Aflatoxine werden in Lsung gebracht, dann wird mit reinem Methanol (nicht mit Methanol-Wasser-Gemisch) zur Marke aufgefllt und gut durchgescht
48、telt. Dann wird exakt 1 ml dieser Gebrauchskalibrierlsung in ein suregewaschenes Glasflschchen (siehe Warnhinweis in 5.7) berfhrt, entsprechend Option B (6.3.3) zur Trockne abgedampft und dann in exakt dem gleichen Volumen erneut gelst, das verwendet wird, um die Proben vor der Injektion erneut zu l
49、sen (6.3). Die Konzentration des Aflatoxins B1in der abgedampften und neu hergestellten Lsung wird in Nanogramm je Milliliter berechnet. Diese Konzentrationswerte werden fr die Berechnung nach 6.6 verwendet. In diesem Fall wird der Kalibrierbereich unverndert bleiben. Tabelle 1 Herstellung von Gebrauchskalibrierlsungen Option A Option B Geb
