1、August 2013DEUTSCHE NORM Normenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL) im DINPreisgruppe 22DIN Deutsches Institut fr Normung e. V. Jede Art der Vervielfltigung, auch auszugsweise, nur mit Genehmigung des DIN Deutsches Institut fr Normung e. V., Berlin, gestattet.ICS 67.050!$7“1
2、932004www.din.deDDIN EN ISO 21571Lebensmittel Verfahren zum Nachweis von gentechnisch modifizierten Organismenund ihren Produkten Nukleinsureextraktion (ISO 21571:2005 + Amd 1:2013);Deutsche Fassung EN ISO 21571:2005 + A1:2013Foodstuffs Methods of analysis for the detection of genetically modified o
3、rganisms and derivedproducts Nucleic acid extraction (ISO 21571:2005 + Amd 1:2013);German version EN ISO 21571:2005 + A1:2013Produits alimentaires Mthodes danalyse pour la dtection des organismes gntiquement modifis et desproduits drivs Extraction des acides nucliques (ISO 21571:2005 + Amd 1:2013);V
4、ersion allemande EN ISO 21571:2005 + A1:2013Alleinverkauf der Normen durch Beuth Verlag GmbH, 10772 BerlinErsatz frDIN EN ISO 21571:2005-05www.beuth.deGesamtumfang 61 SeitenDIN EN ISO 21571:2013-08 2 Nationales Vorwort Dieses Dokument (EN ISO 21571:2005 + A1:2013) wurde vom SC 16 Horizontal methods
5、for molecular biomarker analysis“ des Technischen Komitees ISO/TC 34 Food products“ in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe 11 Gentechnisch modifizierte Lebensmittel“ des Technischen Komitees CEN/TC 275 Lebensmittelanalytik Horizontale Verfahren“ (Sekretariat: DIN, Deutschland) unter der Wiener Vere
6、inbarung parallel erarbeitet. Die Mitarbeit des DIN in der CEN/TC 275/WG 11 und im ISO/TC 34/SC 16 wird ber den Arbeitsausschuss NA 057-01-04 AA Gentechnisch modifizierte Lebensmittel“ des Normenausschusses Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL) wahrgenommen. Dieses Dokument enthlt die
7、nderung A1, die von CEN am 2013-03-01 angenommen wurde. Der Beginn und das Ende eines Textes, der durch die nderung eingefgt oder gendert wurde, wird im Text durch die Markierungen !“ angezeigt. Fr die in diesem Dokument zitierten Internationalen Normen wird im Folgenden auf die entsprechenden Deuts
8、chen Normen hingewiesen: ISO 21569 siehe DIN EN ISO 21569 ISO 21570 siehe DIN EN ISO 21570 ISO 24276 siehe DIN EN ISO 24276 nderungen Gegenber DIN EN ISO 21571:2005-05 wurden folgende nderungen vorgenommen: a) die Verweisung auf die geplante aber nicht erarbeitete EN ISO 21568 wurde gelscht; b) die
9、Verweisung auf die ISO 24276:2006 wurde aktualisiert; c) die Anforderung an Laborproben in 5.1.2 wurde klarer formuliert; d) die Empfehlung, die Qualitt der extrahierten DNA zu untersuchen, wurde in Abschnitt 6 aufgenommen; e) ein neues Verfahren zur Extraktion von Sojalecithin wurde als A.5.2 aufge
10、nommen; f) das gesamte Dokument wurde redaktionell (Funoten) angeglichen. Frhere Ausgaben DIN EN ISO 21571: 2005-05 DIN EN ISO 21571:2013-08 3 Nationaler Anhang NA (informativ) Literaturhinweise DIN EN ISO 21569 Lebensmittel Verfahren zum Nachweis von gentechnisch modifizierten Organismen und ihren
11、Produkten Qualitative auf Nukleinsuren basierende Verfahren DIN EN ISO 21570 Lebensmittel Verfahren zum Nachweis von gentechnisch modifizierten Organismen und ihren Produkten Quantitative auf Nukleinsuren basierende Verfahren DIN EN ISO 24276 Lebensmittel Auf Nukleinsuren basierende Verfahren zum Na
12、chweis von gentechnisch modifizierten Organismen und ihren Produkten Allgemeine Anforderungen und Definitionen DIN EN ISO 21571:2013-08 4 Leerseite EUROPISCHE NORM EUROPEAN STANDARD NORME EUROPENNE EN ISO 21571 Februar 2005 +A1 Mrz 2013 ICS 67.050 Deutsche Fassung Lebensmittel Verfahren zum Nachweis
13、 von gentechnisch modifizierten Organismen und ihren Produkten Nukleinsureextraktion (ISO 21571:2005 + Amd 1:2013) Foodstuffs Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products Nucleic acid extraction (ISO 21571:2005 + Amd 1:2013) Produits alimentaires Mthod
14、es danalyse pour la dtection des organismes gntiquement modifis et des produits drivs Extraction des acides nucliques (ISO 21571:2005 + Amd 1:2013) Diese Europische Norm wurde vom CEN am 14. Februar 2005 angenommen. Diese nderung A1 modifiziert die Europische Norm EN ISO 21571:2005. Sie wurde vom CE
15、N am 1. Mrz 2013 angenommen. Die CEN-Mitglieder sind gehalten, die CEN/CENELEC-Geschftsordnung zu erfllen, in der die Bedingungen festgelegt sind, unter denen dieser Europischen Norm ohne jede nderung der Status einer nationalen Norm zu geben ist. Auf dem letzten Stand befindliche Listen dieser nati
16、onalen Normen mit ihren bibliographischen Angaben sind beim Management-Zentrum oder bei jedem CEN-Mitglied auf Anfrage erhltlich. Diese Europische Norm besteht in drei offiziellen Fassungen (Deutsch, Englisch, Franzsisch). Eine Fassung in einer anderen Sprache, die von einem CEN-Mitglied in eigener
17、Verantwortung durch bersetzung in seine Landessprache gemacht und dem Management-Zentrum mitgeteilt worden ist, hat den gleichen Status wie die offiziellen Fassungen. CEN-Mitglieder sind die nationalen Normungsinstitute von Belgien, Bulgarien, Dnemark, Deutschland, der ehemaligen jugoslawischen Repu
18、blik Mazedonien, Estland, Finnland, Frankreich, Griechenland, Irland, Island, Italien, Kroatien, Lettland, Litauen, Luxemburg, Malta, den Niederlanden, Norwegen, sterreich, Polen, Portugal, Rumnien, Schweden, der Schweiz, der Slowakei, Slowenien, Spanien, der Tschechischen Republik, der Trkei, Ungar
19、n, dem Vereinigten Knigreich und Zypern. EUROPISCHES KOMITEE FR NORMUNG EUROPEAN COMMITTEE FOR STANDARDIZATION COMIT EUROPEN DE NORMALISATION Management-Zentrum: Avenue Marnix 17, B-1000 Brssel 2013 CEN Alle Rechte der Verwertung, gleich in welcher Form und in welchem Verfahren, sind weltweit den na
20、tionalen Mitgliedern von CEN vorbehalten. Ref. Nr. EN ISO 21571:2005 + A1:2013 D EN ISO 21571:2005 + A1:2013 (D) 2 Inhalt Seite Vorwort 3 !Vorwort A1 .3 1 Anwendungsbereich .5 2 Normative Verweisungen 5 3 Kurzbeschreibung .5 3.1 Allgemeines 5 3.2 DNA-Extraktion 5 3.3 Quantitative Bestimmung der DNA
21、5 4 Allgemeine Anforderungen an Laboratorien 6 5 Durchfhrung .6 5.1 Vorbereitung der Untersuchungsprobe 6 5.2 DNA-Extraktion/-Reinigung 8 5.3 Quantitative Bestimmung der extrahierten DNA 9 5.4 Stabilitt der extrahierten DNA 10 6 Auswertung . 10 7 Untersuchungsbericht . 10 Anhang A (informativ) Verfa
22、hren zur DNA-Extraktion 11 A.1 Prparation von DNA mit PCR-Qualitt unter Anwendung von DNA-Extraktionsverfahren mit Phenol/Chloroform . 11 A.1.1 Grundlegendes Phenol-/Chloroform-Verfahren 11 A.1.2 Phenol-/Chloroform-Verfahren: Vorschrift fr Rohwurst-Starterkulturen 14 A.1.3 Phenol-/Chloroform-Verfahr
23、en: Vorschrift fr Joghurt-Starterkulturen . 18 A.1.4 Phenol-/Chloroform-Verfahren: Vorschrift fr Hefen und/oder Fadenpilze, die aus Lebensmitteln gewonnen wurden . 22 A.2 Prparation von DNA mit PCR-Qualitt unter Anwendung von DNA-Extraktionsverfahren mit Polyvinyl-Pyrrolidon (PVP) 26 A.2.1 Grundlege
24、ndes PVP-Verfahren . 26 A.3 Prparation von DNA mit PCR-Qualitt unter Anwendung von DNA-Extraktionsverfahren mit CTAB 29 A.3.1 Grundlegendes CTAB-Verfahren 29 A.4 Prparation von DNA mit PCR-Qualitt unter Anwendung von DNA-Extraktionsverfahren mit Siliciumdioxid . 33 A.4.1 Grundlegendes Siliciumdioxid
25、-Verfahren 33 A.5 Prparation von DNA mit PCR-Qualitt unter Anwendung von DNA-Extraktionsverfahren mit Guanidin-Chloroform . 37 A.5.1 Grundlegendes Guanidin-Chloroform-Verfahren 37 A.5.2 Guanidin-Chloroform-Verfahren: Vorschrift fr Sojalecithin . 39 Anhang B (informativ) Verfahren zur quantitativen B
26、estimmung der extrahierten DNA 48 B.1 Grundlegendes UV-spektralphotometrisches Verfahren . 48 B.2 Agarose-Gelelektrophorese und Ethidiumbromid-Frbung. 50 B.3 Verfahren zur quantitativen Bestimmung extrahierter DNA durch Real Time PCR . 54 Literaturhinweise . 55 DIN EN ISO 21571:2013-08 EN ISO 21571:
27、2005 + A1:2013 (D) 3 Vorwort Dieses Dokument (EN ISO 21571:2005) wurde vom Technischen Komitee CEN/TC 275 Lebensmittel-analytik Horizontale Verfahren“ dessen Sekretariat vom DIN gehalten wird, in Zusammenarbeit mit dem Technischen Komitee ISO/TC 34 Food products“ erarbeitet. Diese Europische Norm mu
28、ss den Status einer nationalen Norm erhalten, entweder durch Verffentlichung eines identischen Textes oder durch Anerkennung bis August 2005, und etwaige entgegenstehende nationale Normen mssen bis August 2005 zurckgezogen werden. Entsprechend der CEN-CENELEC-Geschftsordnung sind die nationalen Norm
29、ungsinstitute der folgenden Lnder gehalten, diese Europische Norm zu bernehmen: Belgien, Dnemark, Deutschland, Estland, Finnland, Frankreich, Griechenland, Irland, Island, Italien, Lettland, Litauen, Luxemburg, Malta, Niederlande, Norwegen, sterreich, Polen, Portugal, Schweden, Schweiz, Slowakei, Sl
30、owenien, Spanien, Tschechische Republik, Ungarn, Vereinigtes Knigreich und Zypern. !Vorwort A1 Dieses Dokument (EN ISO 21571:2005/A1:2013) wurde vom Technischen Komitee ISO/TC 34 Food products“ in Zusammenarbeit mit dem Technischen Komitee CEN/TC 275 Lebensmittelanalytik Horizontale Verfahren“ erarb
31、eitet, dessen Sekretariat vom DIN gehalten wird. Diese nderung zur Europischen Norm EN ISO 21571:2005 muss den Status einer nationalen Norm erhalten, entweder durch Verffentlichung eines identischen Textes oder durch Anerkennung bis September 2013, und etwaige entgegenstehende nationale Normen mssen
32、 bis September 2013 zurckgezogen werden. Es wird auf die Mglichkeit hingewiesen, dass einige Elemente dieses Dokuments Patentrechte berhren knnen. CEN und/oder CENELEC sind nicht dafr verantwortlich, einige oder alle diesbezglichen Patentrechte zu identifizieren. Entsprechend der CEN-CENELEC-Geschft
33、sordnung sind die nationalen Normungsinstitute der folgenden Lnder gehalten, diese Europische Norm zu bernehmen: Belgien, Bulgarien, Dnemark, Deutschland, die ehemalige jugoslawische Republik Mazedonien, Estland, Finnland, Frankreich, Griechenland, Irland, Island, Italien, Kroatien, Lettland, Litaue
34、n, Luxemburg, Malta, Niederlande, Norwegen, sterreich, Polen, Portugal, Rumnien, Schweden, Schweiz, Slowakei, Slowenien, Spanien, Tschechische Republik, Trkei, Ungarn, Vereinigtes Knigreich und Zypern. Anerkennungsnotiz Der Text von ISO 21571:2005/Amd 1:2013 wurde vom CEN als EN ISO 21571:2005/A1:20
35、13 ohne irgendeine Abnderung genehmigt.“ DIN EN ISO 21571:2013-08 EN ISO 21571:2005 + A1:2013 (D) 4 Einleitung Die berprfung auf transgene Herkunft von Zutaten wird nach folgenden Schritten nacheinander (oder gleichzeitig) durchgefhrt. Nach der Probenahme werden die Nukleinsuren aus der Untersuchung
36、sprobe extrahiert. Die extrahierten Nukleinsuren knnen bei oder nach dem Extraktionsverfahren weiter gereinigt werden. Danach werden sie quantitativ bestimmt (falls erforderlich), verdnnt (falls erforderlich) und analytisch untersucht (wie z. B. mit einer Polymerase-Kettenreaktion, PCR). Diese Schri
37、tte werden ausfhrlich in dieser und in den folgenden Normen behandelt: !gestrichener Text“ ISO 21569, Foodstuffs Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products - Qualitative nucleic acid based methods ISO 21570, Foodstuffs Methods of analysis for the det
38、ection of genetically modified organisms and derived products Quantitative nucleic acid based methods Weitere Angaben zu Definitionen und allgemeinen Gesichtspunkten zu den oben angefhrten Schritten sind zusammengefasst in: ISO 24276, !Foodstuffs Methods of analysis for the detection of genetically
39、modified organisms and derived products General requirements and definitions“ Die Internationale Organisation fr Normung (ISO) weist darauf hin, dass die bereinstimmung mit diesem Dokument die Verwendung eines Patents hinsichtlich des Extraktionsverfahren mit Siliciumdioxid (No EP 0389063/USP 5,234,
40、809) in Abschnitt A.4 bedeuten kann. Die ISO nimmt keine Stellung zur Rechtmigkeit, zur Gltigkeit und zum Anwendungsbereich dieser Patent-rechte. Der Halter dieser Patentrechte hat ISO zugesichert, dass er bereit ist, ber Lizenzen zu vernnftigen und nicht diskriminierenden Geschftsbedingungen mit An
41、tragstellern in der ganzen Welt zu verhandeln. In diesem Zusammenhang ist die Erklrung des Halters dieser Patentrechte bei ISO registriert. Informationen sind erhltlich bei: Jean Deleforge BioMrieux Chemin de lOrme, 69280 Marcy ltoile, France. Es wird auf die Mglichkeit hingewiesen, dass einige Text
42、e dieses Dokuments Patentrechte berhren knnen, ohne dass diese vorstehend identifiziert wurden. ISO ist nicht dafr verantwortlich, einige oder alle diesbezglichen Patentrechte zu identifizieren. DIN EN ISO 21571:2013-08 EN ISO 21571:2005 + A1:2013 (D) 5 1 Anwendungsbereich Diese Internationale Norm
43、legt allgemeine Anforderungen an und spezifische Verfahren fr die Extraktion/Reinigung von DNA und die quantitative Bestimmung fest. Diese Verfahren sind in den Anhngen A und B beschrieben. Diese Internationale Norm wurde fr Lebensmittelmatrices erarbeitet, knnte jedoch mit einigen Anpassungen auch
44、auf andere Matrices wie Getreide und Futtermittel angewendet werden. Diese Norm wurde als ein integraler Bestandteil von auf Nukleinsuren basierenden analytischen Verfahren, insbesondere ISO 21569 zu qualitativen analytischen Verfahren und ISO 21570 zu quantitativen analytischen Verfahren erarbeitet
45、. 2 Normative Verweisungen Die folgenden zitierten Dokumente sind fr die Anwendung dieses Dokuments erforderlich. Bei datierten Verweisungen gilt nur die in Bezug genommene Ausgabe. Bei undatierten Verweisungen gilt die letzte Ausgabe des in Bezug genommenen Dokuments (einschlielich aller nderungen)
46、. ISO 24276:!2006“, Foodstuffs Nucleic acid based methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products General requirements and definitions !gestrichener Text“ 3 Kurzbeschreibung 3.1 Allgemeines Das Ziel der Nukleinsure-Extraktionsverfahren ist die Bereitstell
47、ung von Nukleinsuren, die fr die nachfolgende Analyse geeignet sind (siehe ISO 24276). ANMERKUNG Die Qualitt“ der DNA bezieht sich auf die mittlere Lnge der extrahierten DNA-Molekle, die chemische Reinheit und die strukturelle Unversehrtheit der DNA-Sequenz und der Doppelhelix, z. B. Vernetzungen zw
48、ischen DNA-Basen innerhalb eines Stranges und zwischen Strngen, Einzelstranglcken, Quervernetzungen (en: cross-linking) mit Polyolen, Hmin usw. Auerdem sind derartige Vernderungen hufig sequenzspezifisch und demzufolge nicht nach dem Zufallsprinzip ber das gesamte Genom verteilt, siehe 1, 2, 3 und 4
49、. Anwender dieser Internationalen Norm sollten bercksichtigen, dass einige Verfahren, z. B. smtliche auf Siliciumdioxid basierenden Verfahren, patentrechtlich geschtzt sein knnen. 3.2 DNA-Extraktion Das Grundprinzip der DNA-Extraktion besteht in der Freisetzung der in der Matrix vorhandenen DNA und auerdem in der gleichzeitigen oder anschlieenden
