1、Juni 2011 Normenausschuss Wasserwesen (NAW) im DINPreisgruppe 13DIN Deutsches Institut fr Normung e. V. Jede Art der Vervielfltigung, auch auszugsweise, nur mit Genehmigung des DIN Deutsches Institut fr Normung e. V., Berlin, gestattet.ICS 13.080.30Zur Erstellung einer DIN SPEC knnen verschiedene Ve
2、rfahrensweisen herangezogen werden: Das vorliegende Dokument wurde nach den Verfahrensregeln einer Vornorm erstellt.!$nu“1759482www.din.deDDIN ISO/TS 10832Bodenbeschaffenheit Wirkung von Schadstoffen auf Mykorrhizapilze Sporenkeimtest (ISO/TS 10832:2009, korrigierte Fassung 2010-01-15)Soil quality E
3、ffects of pollutants on mycorrhizal fungi Spore germination test (ISO/TS 10832:2009, corrected version 2010-01-15)Qualit du sol Effets des polluants vis-vis des champignons mycorhizognes Essai de germination des spores (ISO/TS 10832:2009, version corrige 2010-01-15)Alleinverkauf der Spezifikationen
4、durch Beuth Verlag GmbH, 10772 Berlin www.beuth.deGesamtumfang 25 SeitenDIN SPEC 91200DIN ISO/TS 10832 (DIN SPEC 91200):2011-06 Inhalt Seite Nationales Vorwort 3 Einleitung 5 1 Anwendungsbereich 6 2 Normative Verweisungen. 6 3 Begriffe und Abkrzungen. 6 4 Prfverfahren 7 4.1 Kurzbeschreibung 7 4.2 Ve
5、rsuchsbedingungen . 8 5 Prfmaterialien 8 5.1 Destilliertes Wasser 8 5.2 Biologisches Material. 8 5.3 Kontrollsubstrat 8 5.4 Referenzsubstanz . 9 5.5 Trypanblau. 9 5.6 Gerte. 9 6 Lagerung und Vorbereitung der Proben 10 7 Durchfhrung 10 7.1 Biologisches System 10 7.2 Vorbereitung des Prfgemischs .11 7
6、.3 Vorbereitung der Prfanstze . 12 7.4 Wahl der zu prfenden Konzentration 13 7.5 Kultivierungsbedingungen 14 7.6 Abschluss der Prfung 14 8 Berechnung und Angabe der Ergebnisse 14 8.1 Berechnung. 14 8.2 Angabe der Ergebnisse 14 9 Gltigkeitskriterien . 14 10 Prfbericht. 15 Anhang A (informativ) Versuc
7、hsvorrichtung 16 Anhang B (informativ) Beispiel fr eine Ergebnistabelle. 17 Anhang C (informativ) Beispiele von Ergebnissen. 18 Anhang D (informativ) Przisionsdaten . 20 Literaturhinweise . 23 2 DIN ISO/TS 10832 (DIN SPEC 91200):2011-06 Nationales Vorwort Eine DIN SPEC nach dem Vornorm-Verfahren ist
8、 das Ergebnis einer Normungsarbeit, das wegen bestimmter Vorbehalte zum Inhalt oder wegen des gegenber einer Norm abweichenden Aufstellungsverfahrens vom DIN noch nicht als Norm herausgegeben wird. Erfahrungen mit dieser DIN SPEC sind erbeten vorzugsweise als Datei per E-Mail an nawdin.de in Form ei
9、ner Tabelle. Die Vorlage dieser Tabelle kann im Internet unter http:/www.din.de/stellungnahme abgerufen werden; oder in Papierform an den Normenausschuss Wasserwesen (NAW) im DIN Deutsches Institut fr Normung e. V., 10772 Berlin (Hausanschrift: Burggrafenstrae 6, 10787 Berlin). Diese Technische Spez
10、ifikation wurde vom Technischen Komitee ISO/TC 190 Soil quality“ aufgestellt. Das zustndige deutsche Gremium ist der NA 119-01-02-04 UA Biologische Verfahren“. Fr die in diesem Dokument zitierten internationalen Dokumente wird im Folgenden auf die entsprechenden deutschen Dokumente hingewiesen: ISO
11、10381-6 siehe DIN ISO 10381-6 ISO 10390 siehe DIN ISO 10390 ISO 11263 siehe DIN ISO 11263 ISO 11268-1 siehe DIN ISO 11268-1 ISO 11274 siehe DIN ISO 11274 ISO 11465 siehe DIN ISO 11465 3 DIN ISO/TS 10832 (DIN SPEC 91200):2011-06 Nationaler Anhang NA (informativ) Literaturhinweise DIN ISO 10381-6, Bod
12、enbeschaffenheit Probenahme Teil 6: Anleitung zur Entnahme, Behandlung und Lagerung von Boden unter aeroben Bedingungen fr die Beurteilung mikrobiologischer Prozesse sowie der Biomasse und der Diversitt unter Laboratoriumsbedingungen DIN ISO 10390, Bodenbeschaffenheit Bestimmung des pH-Wertes DIN IS
13、O 11263, Bodenbeschaffenheit Bestimmung von Phosphor Spektrometrische Bestimmung des natriumhydrogencarbonatlslichen Phosphors DIN ISO 11268-1, Bodenbeschaffenheit Wirkungen von Schadstoffen auf Regenwrmer (Eisenia fetida/Eisenia andrei) Teil 1: Bestimmung der akuten Toxizitt DIN ISO 11274, Bodenbes
14、chaffenheit Bestimmung des Wasserrckhaltevermgens Laborverfahren DIN ISO 11465, Bodenbeschaffenheit Bestimmung der Trockensubstanz und des Wassergehalts auf Grundlage der Masse Gravimetrisches Verfahren 4 DIN ISO/TS 10832 (DIN SPEC 91200):2011-06 Bodenbeschaffenheit Wirkung von Schadstoffen auf Myko
15、rrhizapilze Sporenkeimtest Einleitung Mykorrhizapilze sind wichtige Bestandteile der Lebensgemeinschaft von Bodenmikroorganismen und Schls-selorganismen in Pflanze-Boden-Systemen. Die von ihnen gebildete Wurzelsymbiose stellt eine direkte Ver-bindung zwischen dem Boden und der groen Mehrheit (80 %)
16、der Gefpflanzenarten in natrlichen und landwirtschaftlich geprgten kosystemen dar. Mykorrhizapilze haben mehrere Vorteile fr die Wirtspflanze. Dazu zhlen ein strkeres Wachstum, verbesserte Mineralstoffernhrung, grere Trockenheitsresistenz und Schutz vor Krankheitserregern und Belastung durch Schwerm
17、etalle. Mehrere Studien haben gezeigt, dass Mykorrhizapilze empfindlich gegenber Schadstoffen, wie metallischen Spurenelementen und polycyclischen aromatischen Kohlenwasserstoffen, sowie gegenber Klrschlmmen sind, selbst wenn keine phytotoxischen Wirkungen auf die Wirtspflanze beobachtet wurden. Da
18、Mykor-rhizapilze die meisten Kriterien fr Bioindikatororganismen erfllen (ubiquitr im Boden, empfindlich gegen-ber Schadstoffen, kologisch relevant fr Pflanzengesundheit und kosysteme), scheint es wichtig zu sein, sie bei der Bewertung von Gefhrdungen und Umweltrisiken, die mit Schadstoffen, verunre
19、inigten Bden und der Verwendung von Klrschlamm in der Landwirtschaft verbunden sind, zu bercksichtigen. Die Sporenkeimung durch einen arbuskulren Mykorrhizapilz, Glomus mosseae, bildet die Grundlage des vorgeschlagenen Prfverfahrens. Der erste Schritt der Symbiose wird in diesem Verfahren bercksicht
20、igt, whrend ein weiteres Verfahren auf der Grundlage der Wurzelbesiedlung der Wirtspflanze in Vorbereitung ist. Dieses Verfahren kann ohne Extraktionsschritt direkt an Schlmmen oder Bden durchgefhrt werden. 5 DIN ISO/TS 10832 (DIN SPEC 91200):2011-06 1 Anwendungsbereich Dieses Dokument legt ein Verf
21、ahren zur Bewertung der akuten Wirkung von Schadstoffen auf die Sporenkeimung des Mykorrhizapilzes Glomus mosseae fest. Dieser akute Toxizitts-Biotest ermglicht die Bewertung der Wirkungen von Schadstoffen und verunreinigten Bden auf ntzliche Bodenmikroorganismen, die fr das Pflanzenwachstum im Rahm
22、en des Konzepts einer nachhaltigen Landwirtschaft wichtig sind. Dieses Dokument ist anwendbar auf chemische Substanzen und verunreinigte Bden, Abflle und Boden-Abfall-Gemische sowie Schlmme. 2 Normative Verweisungen Die folgenden zitierten Dokumente sind fr die Anwendung dieses Dokuments erforderlic
23、h. Bei datierten Verweisungen gilt nur die in Bezug genommene Ausgabe. Bei undatierten Verweisungen gilt die letzte Ausgabe des in Bezug genommenen Dokuments (einschlielich aller nderungen). ISO 10381-6, Soil quality Sampling Part 6: Guidance on the collection, handling and storage of soil under aer
24、obic conditions for the assessment of microbiological processes, biomass and diversity in the laboratory ISO 10390, Soil quality Determination of pH ISO 11263, Soil quality Determination of phosphorus Spectrometric determination of phosphorus soluble in sodium hydrogen carbonate solution ISO 11268-1
25、, Soil quality Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida) Part 1: Determination of acute toxicity using artificial soil substrate ISO 11274, Soil quality Determination of the water-retention characteristic Laboratory methods ISO 11465, Soil quality Determination of dry matter and water con
26、tent on a mass basis Gravimetric method 3 Begriffe und Abkrzungen Fr die Anwendung dieses Dokuments gelten die folgenden Begriffe und Abkrzungen. 3.1 Mykorrhizapilz ubiquitrer Mikroorganismus, der eine symbiotische Lebensgemeinschaft mit den Wurzeln von Gefpflanzenarten eingeht 3.2 BEG die internati
27、onale Bank (Kultursammlung) fr Glomeromycota 3.3 Spore ungeschlechtliche Fortpflanzungseinheit eines Pilzes 3.4 Sporokarp von Myzel umgebene Sporengruppe 6 DIN ISO/TS 10832 (DIN SPEC 91200):2011-06 3.5 Myzel Geflecht aus verzweigten Hyphen 3.6 Hyphen Fden, aus denen das Pilzmyzel besteht 3.7 Kontrol
28、lsubstrat inertes Substrat, das die Sporenkeimung nicht beeinflusst und als Kontrollprobe oder Verdnnungsmittel verwendet wird 3.8 Matrix zu prfender Boden, Schlamm oder Abfall 3.9 Sandwich Vorrichtung, die aus zwei Nitrocellulose-Membranfiltern, die die Sporen enthalten, besteht ANMERKUNG Die beide
29、n Membranen werden durch zwei Diarahmen zusammengehalten. 3.10 Frbung mit Trypanblau Nichtvitalfrbung mit Trypanblau, um die Strukturen von Mykorrhizapilzen sichtbar zu machen (Blaufrbung) 3.11 Prfgemisch Gemisch aus Prfsubstanz oder Matrix und Kontrollsubstrat 3.12 Hemmungskonzentration ICxKonzentr
30、ation der Prfsubstanz oder Matrix, die eine x-%ige Hemmung der Sporenkeimung im Vergleich zur Kontrollprobe hervorruft ANMERKUNG Massenanteil“ wird in biologischen Verfahren oft als Konzentration“ bezeichnet. 4 Prfverfahren 4.1 Kurzbeschreibung Sporen von Glomus mosseae werden zwischen zwei Nitrocel
31、lulose-Membranfiltern angeordnet. Diese bilden ein Sandwich (3.9), das in eine Petrischale gelegt wird. Die Petrischale enthlt das Prfgemisch (3.11), bestehend aus Prfsubstanz oder Matrix (3.8) in verschiedenen Konzentrationen, mit dem Kontrollsubstrat (3.7) verdnnt oder nicht. Der prozentuale Antei
32、l gekeimter Sporen wird nach 14 Tagen bestimmt. Die Ergebnisse werden mit einem Kontrollsubstrat verglichen und zur Abschtzung der Konzentration fr eine 50%ige Hemmung der Sporenkeimung (IC50) verwendet. Die Bestimmung eines anderen ICxist auch mglich, jedoch nicht erforderlich. ANMERKUNG Dieses Ver
33、fahren kann zur Bestimmung der Wirkung einer einzelnen Konzentration angewendet werden. 7 DIN ISO/TS 10832 (DIN SPEC 91200):2011-06 4.2 Versuchsbedingungen Eine Wachstumskammer oder ein Wachstumsraum mit einer geregelten Temperatur, (24 2) C, ist zu verwenden. Die Bebrtung erfolgt im Dunkeln (Dunkel
34、kammer oder mit Aluminiumfolie abgedeckte Petrischalen). 5 Prfmaterialien 5.1 Destilliertes Wasser Der pH-Wert des destillierten Wassers sollte neutral und niemals geringer als 5,5 sein. 5.2 Biologisches Material 5.2.1 Pilz Taxonomische Gruppe: Eumycota, Ordnung Glomeromycota. Art: Glomus mosseae (N
35、icolson und Gerdeman) Gerdeman und Trappe (BEG 12). 5.2.2 Entwicklungsstadium Es sind reife Sporen zu verwenden. 5.2.3 Identifizierung Eintragsnummer der Genbank: U96139 (18s-rDNA-Untereinheit); Y07656 (Teilsequenz der 25s-rDNA-Unter-einheit) (25, 26). 5.2.4 Material Im Handel erhltliche1)Sporen (3.
36、3) enthaltende Sporokarpe (3.4) (siehe Bild 1) sind zu verwenden. Fr die Extraktion von Sporokarpen sind Topfkulturen, die weniger als fnf Monate alt sind, zu verwenden. Der Prozentsatz der Sporenkeimung muss mehr als 75 % betragen. Die Sporen und Sporokarpe sind in destilliertem Wasser (5.1) bei 4
37、C zu konservieren. Die Sporokarpe sind innerhalb einer Woche und die Sporen innerhalb von zwei Tagen zu verwenden. 5.3 Kontrollsubstrat Sand oder ein knstlicher Boden nach ISO 11268-1 ist als Kontrollsubstrat (3.7) zu verwenden. Sand aus 99 % Quarz mit einem pH-Wert 6,6 bis 7,5, einer Teilchengre 0,
38、8 mm bis 1,6 mm, dreimal mit destilliertem Wasser (pH-Wert 6) (5.1) gewaschen, anschlieend getrocknet, ist zu verwenden. Der End- pH-Wert muss 6 sein (siehe ISO 10390). Die Sporenkeimung im Kontrollsubstrat muss vor der Durchfhrung des Versuches geprft werden und 75 % betragen. 1)Sporokarpe des Pilz
39、es Glomus mosseae, hergestellt und vertrieben von BioRize, sind ein Beispiel fr ein geeignetes handelsbliches Produkt. Diese Angabe dient nur zur Unterrichtung der Anwender dieses Dokuments und bedeutet keine Anerkennung des genannten Produkts durch ISO.8 DIN ISO/TS 10832 (DIN SPEC 91200):2011-06 5.
40、4 Referenzsubstanz Cadmiumnitrat (CdNO3 4 H2O) ist zu verwenden. Zur Information: in einem mit Cadmiumnitrat durchgefhrten Ringversuch (n = 4) lag der IC50-Wert im Sand zwischen 0,15 mg kg1und 1,7 mg kg1. 5.5 Trypanblau Trypanblau2), 0,5 g in 50 ml 1%iger HCl, 450 ml H2O und 500 ml Glycerol sind zu
41、verwenden. a) Sporokarpe b) geffnetes Sporokarp c) intakte Spore d) aufgebrochene Spore Bild 1 Sporokarpe und Sporen von Glomus mosseae 5.6 Gerte 5.6.1 Binokularmikroskop, 32fache Vergrerung. 5.6.2 Sterile Petrischalen aus Kunststoff, Durchmesser 9 cm. 5.6.3 Diarahmen, 24 mm 36 mm. 5.6.4 Nitrocellul
42、ose-Membranfilter, Durchmesser 47 mm, Porenweite 0,45 m, wei, 3-mm-Gitternetz. 5.6.5 Przisionszange/-pinzette3). 2)Trypanblau, angefhrt unter der Artikelnummer 93595, vertrieben durch Sigma Aldrich, ist ein Beispiel fr ein geeignetes handelsbliches Produkt. Diese Angabe dient nur zur Unterrichtung d
43、er Anwender dieses Dokuments und bedeutet keine Anerkennung des genannten Produkts durch ISO.3)Przisionspipetten, angefhrt unter der Artikelnummer T5130 Nr. 5 und vertrieben durch Oxford Instruments, sind ein Beispiel fr ein geeignetes handelsbliches Produkt. Diese Angabe dient nur zur Unterrichtung
44、 der Anwender dieses Dokuments und bedeutet keine Anerkennung des genannten Produkts durch ISO.9 DIN ISO/TS 10832 (DIN SPEC 91200):2011-06 5.6.6 Filterpapier. 5.6.7 Mikrorhrchen aus Plastik, mit einem Aufnahmevermgen von 1,5 ml. 5.6.8 Kunststofffolie. 5.6.9 Mikropipette und angeschliffene Spitzen. 5
45、.6.10 Waage, mit der eine Masse von 0 g bis 200 g auf 0,001 g gewogen werden kann. 5.6.11 Trichter. 6 Lagerung und Vorbereitung der Proben Bodenproben sind, wie in ISO 10381-6 festgelegt, zu lagern. Abfall- und Schlammproben werden bei (4 2) C in dicht schlieenden Behltern gelagert. Fr mikrobiologis
46、ch aktiven Schlamm und Abfall ver-wendete Behlter sollten nicht vollstndig gefllt sein. Folgende Parameter sollten bei den zu prfenden Bden, Abfllen und Schlmmen bestimmt werden: pH-Wert (siehe ISO 10390); Bden mit einem pH-Wert unter 5,5 sind nicht zu verwenden (siehe 18); Wassergehalt (siehe ISO 1
47、1465); Wasserrckhaltevermgen (siehe ISO 11274); Gehalt an verfgbarem Phosphor (siehe ISO 11263); Konzentration von lslichem Phosphor muss weniger als 100 mg kg-1betragen (siehe 1, 2, 7 und 23. Fr die Durchfhrung des Biotests sind Bden oder Abflle mit einer Teilchengre 4 mm zu verwenden. Andernfalls
48、sollten vor der Herstellung des Prfgemischs Abflle zerkleinert und auf 4 mm ausgesiebt und Bden auf 4 mm ausgesiebt werden. 7 Durchfhrung 7.1 Biologisches System 7.1.1 Kontrolle der Sporen Sporen (3.3) von Glomus mosseae sollten gelb und glnzend sein und ber eine intakte und saubere Hlle verfgen (le
49、ere und aufgebrochene Sporen sollten entfernt werden), siehe auch Bild 1. 7.1.2 Vorbereitung des biologischen Materials Anzahl der einzelnen Sporen fr jede zu prfende Konzentration: 30 Sporen (3.3) je Sandwich (3.9), sechs Parallelproben (Sandwiche) je Konzentration, d. h. 180 Sporen je Konzentration. Die Sporen (3.3) w
